Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

Streszczenie

Źródło: Urwitz, S. N. et al. Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki. J. Vis. Exp. (2019 rok)

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Protokół

1. Oczyszczanie gradientu gęstości

1. Dodaj 1,5 ml 60% jodiksanolu (roztwór podstawowy w wodzie) do 1,5 ml buforu sacharozy/Tris zawierającego EV, aby uzyskać końcowy roztwór zawierający 30% jodiksanolu. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby dokładnie wymieszać roztwór.
   nuta: Należy zachować ostrożność, aby nie stracić roztworu w końcówce pipety, ponieważ wysokie stężenie jodiksanolu jest dość lepkie.
2. Przenieść 30% roztwór buforowy jodiksanolu zawierający EV na dno probówki do ultrawirowania o pojemności 5,5 ml.
3. Przygotować co najmniej 1,5 ml 20% i 10% roztworów jodiksanolu na próbkę w ultraczystej wodzie z 60% roztworu podstawowego jodiksanalu.
4. Odmierz 1,3 ml 20% jodiksanolu i ostrożnie ułóż na dolnej warstwie gradientu za pomocą strzykawki i igły 18 G. Aby uniknąć mieszania warstw na granicy gęstości, należy utrzymywać skos igły w kontakcie z wnętrzem probówki do ultrawirówki tuż nad menisku i dodawać roztwór kroplami.
5. Warstwę 1,2 ml 10% roztworu jodiksanolu nałożyć na warstwę 20% jodiksanolu przy użyciu tej samej techniki, co powyżej.
6. Ostrożnie wyważyć i załadować probówki do ultrawirówki do wiader wirnika i odwirować w wirniku z łyżką obrotową o sile 268 000 x g przez 50 minut w temperaturze 4 °C. Ustawić prędkości przyspieszania i zwalniania wirówki na minimalne dozwolone szybkości, aby uniknąć rozerwania warstw gęstości.
7. Oznaczyć dziesięć probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki, aby odpowiadały frakcjom od 1 do 10 gradientów gęstości. Frakcja 1 jest oznaczona jako najwyższa frakcja, która zostanie usunięta jako pierwsza, podczas gdy frakcja 10 to dolna frakcja usunięta jako ostatnia.
8. Po zakończeniu ultrawirowania gradientowego delikatnie wyjmij rurki z kubełków wirnika i umieść je w stabilnym uchwycie. Widoczne pasmo pęcherzyków często będzie widoczne we fragmencie zainteresowania. Odpipetować dziesięć seryjnych frakcji o objętości 490 μl od góry gradientu do odpowiednich probówek. Na dnie probówki pozostanie niewielka ilość płynu, który prawdopodobnie zawiera zanieczyszczające białka. W razie potrzeby próbkę tę można odrzucić lub zachować jako frakcję 11.
9. Zmierz współczynniki załamania frakcji za pomocą refraktometru. Można to również przeprowadzić przy równoległym przebiegu gradientu kontrolnego, jeśli konieczne jest zachowanie próbki. Pobrać pipetę 20–30 μl każdej frakcji zawierającej jodiksanol na powierzchnię refraktometru i oszacować gęstość, porównując współczynniki załamania światła ze znanymi gęstościami jodiksanalu.
   nuta: W razie potrzeby frakcje można przechowywać przez noc w roztworze zawierającym jodiksanol przed przejściem do następnego etapu mycia ultrawirówką.
10. Przenieść każdą frakcję do czystej probówki do ultrawirowania o pojemności 12 ml. Dodać 5 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) do probówki i mieszać, pipetując powoli w górę i w dół.
    UWAGA: PBS dodawany do próbek powinien być wolny od cząstek, zapewniony przez przefiltrowanie sterylnego PBS przez filtr 0,22 μm i przechowywanie w temperaturze pokojowej, aby uniknąć wytrącania się soli.
11. Dodaj dodatkowe 6 ml 1x PBS na wierzch i ponownie dokładnie wymieszaj.
12. Ultraodwirować probówki o masie 100 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C w celu ponownego osadzenia małych pęcherzyków. Zdekantować supernatant i wysuszyć probówki przed lizą pęcherzyków do analizy białek lub ponownym zawieszeniem EV do analizy morfologicznej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Filtr 0,45 μm	Firma VWR	28145-505
Probówki ultrawirówkowe 12 ml	Beckman Coulter	331372
Probówki ultrawirówkowe 5,5 ml	Beckman Coulter	344057
Wirnik FA-45-6-30	Eppendorf	5820715006
Wirnik wahliwy MLS-50	Beckman Coulter	Numer telefonu 367280
Ultrawirówka stołowa Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315
Ultrawirówka Optima XE-100	Beckman Coulter	A94516
Optiprep (Optiprep	Sigma	Zobacz materiał D1556	60% jodiksanol w sterylnym roztworze wodnym
Refracto 30PX (refraktometr)	METTLER TOLEDO	51324650
Wirnik S-4-104	Eppendorf	5820759003
SW 41 Ti Rotor z łyżką wahliwą	Beckman Coulter	Numer telefonu 333790
Wirówka stołowa 5804R	Eppendorf	22623508