Generowanie indukowanych nerwowych komórek macierzystych (iNSC) z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC): procedura oparta na wirusie Sendai w celu przeprogramowania PBMNC na iNSC

Streszczenie

Źródło: Zheng, W. et al. Generacja indukowanych nerwowych komórek macierzystych z obwodowych komórek jednojądrzastych i różnicowanie w kierunku prekursorów neuronów dopaminergicznych do badań transplantacyjnych.J. Vis. Exp. (2019)

Ten film demonstruje przeprogramowanie komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) na indukowane nerwowe komórki macierzyste (iNSC) za pomocą wirusa Sendai. Wirus Sendai jest nieintegrującym się wirusem, który oferuje skuteczny i bezpieczny pojazd do przeprogramowania komórek.

Protokół

1. Przeprogramowanie PBMNC na iNSC przez infekcję SeV

1. Przygotowanie roztworu i pożywki hodowlanej
   1. Przygotować roztwór podstawowy poli-D-lizyny (PDL), rozpuszczając 100 mg PDL w 100 ml_H2Odo stężenia 1 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 1 ml porcji.
   2. Przygotować podstawowy roztwór insuliny, rozpuszczając 100 mg insuliny w 20 ml 0,01 N HCl do stężenia 5 mg/ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C w 1 ml porcji.
   3. Aby przygotować 200 ml podłoża podstawowego iNSC, połącz 96 ml DMEM-F12 i 96 ml pożywki zasadowej (tabela materiałów) z 2 ml 100x roztworu podstawowego glutaminy, 2 ml aminokwasu endogennego (NEAA), 2 ml suplementu N2 i 2 ml suplementu B27. Przed użyciem dodać 10 ng/ml rekombinowanego czynnika hamującego białaczkę ludzką, 3 μM CHIR99021 i 2 μM SB431542. Przefiltrować pożywkę i przechowywać ją w temperaturze 4 °C.
      nuta: Pożywkę zużyć w ciągu 2 tygodni. Dodać rekombinowany czynnik hamujący białaczkę ludzką, CHIR99021 i SB431542 bezpośrednio przed użyciem.
2. Przeprogramowanie PBMNC na iNSC przez infekcję SeV
   1. Ultrafioletowo-sterylizuj czystą ławkę przed użyciem. Wysterylizuj wszystkie powierzchnie i sprzęt 75% alkoholem. Wysterylizuj wszystkie końcówki za pomocą autoklawu.
   2. W dniu 0 zebrać komórki w pożywce MNC i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml wstępnie podgrzanego podłoża MNC.
   3. Policz żywe komórki za pomocą błękitu trypanowego. Zawiesić komórki za pomocą wstępnie ogrzanego (37 °C) podłoża MNC do stężenia 2 x 10⁵ komórek na studzienkę na płytkach 24-dołkowych.
   4. Po wyjęciu probówek SeV z magazynu w temperaturze -80 °C, należy rozmrozić probówki zawierające SeV w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 5–10 s, a następnie pozostawić je do rozmrożenia w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu natychmiast umieść je na lodzie.
   5. Dodaj do studzienek kodujący SeV ludzkie Klf4, Oct3/4, SOX2 i c-MyC, przy wielokrotności infekcji (MOI) wynoszącej 10. Odwirować komórki z płytkami o wymiarach 1 000 x g przez 30 minut, aby ułatwić łączenie komórek. Pozostawić komórki i supernatant na płytkach. Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
      UWAGA: Wszystkie procedury związane z SeV muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa, a wszystkie końcówki i probówki powinny być traktowane etanolem lub wybielaczem przed usunięciem.
   6. W dniu 1 przenieś pożywkę i komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Przepłucz studzienkę 1 ml pożywki MNC. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 500 μl świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki MNC na płytkach 24-dołkowych.
      nuta: Użyj 24-dołkowej płytki o niskim nasadce, aby zapobiec przyczepianiu się jakichkolwiek komórek przed posiewem na PDL/lamininie.
   7. W dniu 2 rozcieńczyć 1 ml 1 mg/ml PDL z 19 ml D-PBS do stężenia 50 μg/ml. Pokryć płytki 6-dołkowe 50 μg/ml PDL przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej.
   8. Rozcieńczyć 200 μl 0,5 mg/ml lamininy w 20 ml D-PBS do stężenia 5 μg/ml. Odessać PDL do płytek 6-dołkowych i wysuszyć na pionowej czystej ławce.
   9. Pokryć płytki 6-dołkowe 5 μg/ml lamininy i inkubować przez 4–6 godzin w temperaturze 37°C. Przed użyciem przemyć D-PBS.
   10. W dniu 3 poszczepić transdukowane komórki otrzymane w kroku 1.2.6 w pożywce iNSC na 6-dołkowych płytkach pokrytych PDL/lamininą.
       nuta: W razie potrzeby delikatnie przesuwaj płytki po umieszczeniu komórek na płytkach pokrytych PDL/lamininą, starając się nie zakłócać mocowania komórek.
   11. W dniu 5 delikatnie dodać 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki iNSC do każdego dołka na płytkach 6-dołkowych.
       nuta: Oczekuje się, że komórki ulegną drastycznej śmierci (>60%).
   12. W dniu 7 delikatnie dodać 1 ml wstępnie podgrzanej (37 °C) pożywki iNSC do każdego dołka na 6-dołkowych płytkach.
   13. Od 9 do 28 dnia należy codziennie wymieniać zużytą pożywkę na świeżą, wstępnie ogrzaną (37 °C) pożywkę iNSC. Monitorowanie pojawiania się kolonii iNSC. Wybierz i przenieś klony iNSC do ekspansji w ciągu około 2-3 tygodni. Zebrać kolonie o odpowiedniej morfologii za pomocą pipet ze spalonego szkła, wykluczając wszelkie potencjalnie zanieczyszczające komórki, i odessać kolonie za pomocą końcówek o pojemności 200 μl.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Suplement witaminy B27	Invitrogen	17504044
CHIR99021	Operacja genu	04-0004
Zobacz materiał DMEM-F12	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11330
Zobacz materiał DMEM-F12	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11320
Laminina	Roche	11243217001
Suplement N2	Invitrogen	17502048
NEAA (Agencja Zdrowia)	Invitrogen	11140050	Aminokwasy endogenne
Neuropodstawowy	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 10888	Podłoże podstawowe
Pdl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7280	Poli-D-lizyna
SB431542	Operacja genu	04-0010-10mg	Przechowywać od światła w temperaturze -20?
Wirus Sendai	Technologie życiowe	MAN0009378
insulina	Roche	12585014
Płytka 24-dołkowa	Corning	3337
Probówka stożkowa o pojemności 15 ml	Corning	430052
Płytka 6-dołkowa	Corning	Numer katalogowy: 3516
Europejskie Towarzystwo Informacji	Peprotech	100-64-50UG	Ludzka erytropoetyna
Ludzki czynnik hamujący białaczkę	Młyn	LIF1010
Ludzki rekombinowany SCF	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	Numer katalogowy: 100-11-100UG	Ludzki insulinopodobny czynnik wzrostu
IŁ-3	Peprotech	200-03-10UG	Interleukina ludzka 3
deksametazon	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
IMDM (Międzynarodowa Organizacja Zarządzania	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 215056-023	Zmodyfikowany medium Dulbecco firmy Iscove
insulina	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	51500-056	Suplement insuliny-transferyny-selenu-X
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 × Roztwór podstawowy glutaminy
Szynka-F12	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 11765-054
1-tioglicerol	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M6145	Działa toksycznie przez drogi oddechowe i w kontakcie ze skórą
kwas askorbinowy	Sigma-Aldrich	Nr kat. A92902	Działa toksycznie w kontakcie ze skórą
Wymiana surowicy nokautującej	Gibco (firma Gibco)	10828028	Pożywka podstawowa wolna od surowicy
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowy	Invitrogen	11905031
Transferyna	Systemy badawczo-rozwojowe	2914-HT-100G
Trypan niebieski	Gibco (firma Gibco)	Zobacz materiał T10282

SZT. T powiedział: T