Izolacja krążącego DNA wolnego od komórek (cfDNA): procedura membranowa na bazie krzemionki w celu ekstrakcji cfDNA z osocza krwi pacjentów z rakiem

Streszczenie

Źródło: Palande, V. et al. Wykrywanie bezkomórkowego DNA w próbkach osocza krwi pacjentów z rakiem. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film opisuje procedurę membranową opartą na krzemionce, mającą na celu izolację krążącego wolnego od komórek DNA lub cfDNA z próbki ludzkiego osocza. cfDNA jest obiecującym biomarkerem do diagnozowania i oceny raka.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu ludzi i zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję rewizyjną.

1. Oczyszczanie krążącego cfDNA z 1 ml osocza

UWAGA: Ten krok jest wykonywany za pomocą zestawu komercyjnego (patrz Tabela materiałów). Wszystkie zderzaki są dostarczane z zestawem.

1. Przygotowanie i odczynników
   ostrożność: Nie dodawać kwaśnych roztworów ani wybielaczy bezpośrednio do odpadów z przygotowania próbki. Sole guanidyny obecne w buforze do lizy, buforze wiążącym i buforze płuczącym-1 w połączeniu z wybielaczem lub kwasami mogą wytwarzać wysoce reaktywne związki.
   1. Bufor wiążący: Wymieszaj 300 ml koncentratu buforu wiążącego z 200 ml 100% izopropanolu, aby uzyskać 500 ml roboczego buforu wiążącego. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      nuta: Bufor wiążący umożliwia optymalne wiązanie krążących kwasów nukleinowych z błoną krzemionkową. 500 ml buforu wiążącego wystarcza do przetworzenia 276, 138, 92, 69 lub 55 próbek odpowiednio 1, 2, 3, 4 lub 5 ml osocza i jest stabilne przez 1 rok w temperaturze pokojowej.
   2. Wash Buffer-1: Wymieszaj 19 ml koncentratu Wash Buffer-1 z 25 ml 96-100% etanolu, aby uzyskać 44 ml działającego Wash Buffer-1. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      nuta: Wash Buffer-1 eliminuje zanieczyszczenia związane z membraną krzemionkową. 44 ml roboczego buforu do płukania-1 wystarcza do przetworzenia 73 próbek 1/2/3/4/5 ml osocza i jest stabilny przez 1 rok w temperaturze pokojowej.
   3. Wash Buffer-2: Dobrze wymieszaj 13 ml koncentratu Wash Buffer-2 z 30 ml 96-100% etanolu, aby uzyskać 43 ml działającego Wash Buffer-2. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
      nuta: Wash Buffer-2 eliminuje zanieczyszczenia związane z membraną krzemionkową. 43 ml działającego buforu do płukania-2 wystarcza do przetworzenia ~56 próbek 1/2/3/4/5 ml osocza i jest stabilny przez 1 rok w temperaturze pokojowej.
   4. Do probówki zawierającej 310 μg liofilizowanego nośnika RNA dodać 1,550 μl buforu elucyjnego, aby przygotować roztwór nośnego RNA o stężeniu 0,2 μg/μl. Po dokładnym rozpuszczeniu nośnego RNA, podzielić roztwór na odpowiednie podwielokrotności i przechowywać w temperaturze od -30 °C do -15 °C. Nie zamrażaj i nie rozmrażaj tych porcji więcej niż 3 razy. Do buforu do lizy, jak pokazano w tabeli 1, dodać odtworzony nośnikowy RNA rozpuszczony w buforze elucyjnym.
      nuta: Ponieważ nośnik RNA nie rozpuszcza się bezpośrednio w buforze Lysis, musi zostać rozpuszczony najpierw w buforze elucyjnym, a następnie w buforze Lysis. Po pierwsze, wiązanie błony krzemionkowej z kwasami nukleinowymi jest wzmocnione, gdy w próbce znajduje się bardzo mało cząsteczek docelowych. Po drugie, ryzyko degradacji RNA jest zmniejszone ze względu na obecność dużych ilości nośnego RNA.
2. Przed rozpoczęciem izolacji należy doprowadzić kolumny i próbki do temperatury pokojowej i w razie potrzeby dostosować objętość próbki do 1 ml za pomocą sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Podgrzej 2 łaźnie wodne lub bloki grzewcze, które zawierają 50 ml probówek wirówkowych i 2 ml probówek zbiorczych, odpowiednio do 60 °C i 56 °C.
3. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodaj 100 μl proteinazy K, 1 ml osocza i 0,8 ml buforu do lizy zawierającego 1,0 μg nośnego RNA (przygotowanego w kroku 1.1.4). Zamknąć probówkę wirówkową nakrętką i mieszać zawartość przez wirowanie impulsowe przez 30 s, zapewniając jednocześnie widoczny wir w probówce. Dokładne wymieszanie zawartości jest ważne dla efektywnej lizy.
   nuta: Natychmiast po wirowaniu przejdź do kroku 1.4 bez zwłoki.
4. Inkubować roztwór w temperaturze 60 °C przez 30 minut.
5. Zdejmij nakrętkę, dodaj 1,8 ml buforu wiążącego do probówki i dokładnie mieszaj z wirowaniem pulsacyjnym przez 15–30 s po umieszczeniu nakrętki.
6. Powstałą mieszaninę inkubować przez 5 minut na lodzie i włożyć kolumnę z membraną krzemionkową do aparatu próżniowego podłączonego do pompy próżniowej. Następnie mocno włóż przedłużacz probówki o pojemności 20 ml do otwartej kolumny, aby zapobiec wyciekowi próbki.
7. Ostrożnie wlej inkubowaną mieszaninę do przedłużacza rurki kolumny i włącz pompę próżniową. Po całkowitym przejściu mieszaniny lizatu przez kolumny, wyłącz pompę próżniową, zwolnij ciśnienie do 0 mbar, a następnie wyjmij i wyrzuć przedłużacz rurki.
   nuta: Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, przedłużacz rurki należy ostrożnie wyrzucić, aby zapobiec jego rozprzestrzenianiu się po sąsiednich kolumnach.
8. Wyjąć kolumnę z aparatu próżniowego, włożyć do probówki zbiorczej i odwirować przy 11 000 x g przez 30 s w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki lizatu. Odrzuć przepływ.
9. Dodać 600 μl buforu do płukania-1 do kolumny, odwirować przy 11 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, odrzucić przepływ.
10. Dodać 750 μl buforu do płukania-2 do kolumny, odwirować przy 11 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ.
11. Dodać 750 μl etanolu (96–100%) do kolumny, odwirować przy 11 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej i odrzucić przepływ.
12. Odwirować kolumnę o stężeniu 20 000 x g przez 3 minuty, umieszczając ją w czystej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml.
13. Całkowicie wysuszyć zespół kolumny membranowej, umieszczając go w nowej probówce zbiorczej o pojemności 2 ml z otwartą pokrywą i inkubując w temperaturze 56 °C przez 10 minut.
14. Umieścić kolumnę w czystej probówce elucyjnej o pojemności 1,5 ml. Na środek membrany kolumny nanieść 20–150 μl buforu elucyjnego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty przy zamkniętej pokrywie.
    nuta: Upewnij się, że bufor elucyjny jest zrównoważony do temperatury pokojowej. W przypadku stosowania buforu elucyjnego o objętości mniejszej niż 50 μl, należy upewnić się, że jest on ostrożnie dozowany na środek membrany. Pomaga to w całkowitej elucji związanego DNA. Jednak objętość elucji nie jest stała i można ją zmieniać zgodnie z dalszymi aplikacjami. Odzyskany eluat może wynosić do 5 μl, a na pewno mniej niż objętość elucji zastosowana do kolumny.
15. Odzyskany eluat odwirować w mikrowirówce o sile 20 000 x g przez 1 minutę w celu wymycia kwasów nukleinowych i przechowywać w temperaturze -20 °C.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. Rozdział pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Numer próby	Bufor do lizy (ml)	Nośnik RNA w buforze elucyjnym (μL)
1	0,9	5,6
cyfra arabska	1.8	Rozdział 11.3
3	2.6	Rozdział 16,9
4	3,5	22,5
5	4.4	Rozdział 28,1
6	5.3	33,8
7	6.2	39,4
8	7	Rozdział 45
9	7,9	50,6
10	8,8	56,3
11	Pytanie 9,7	61,9
12	Rozdział 10.6	67,5
13	Pytanie 11,4	73,1
14	Rozdział 12.3	78,8
15	Rozdział 13,2	84,4
16	Rozdział 14,1	90
17	15	95,6
Rozdział 18	Rozdział 15,8	101,3
Rozdział 19	Rozdział 16,7	106,9
20	Rozdział 17,6	112,5 pkt.
21	18,5	118,1
22 Rozdział 22	Rozdział 19,4	123,8
23	Rozdział 20,2	129,4
24	Dnia 21,1	135 Rozdział 135

Tabela 1. Objętości buforu do lizy i nośnego RNA (rozpuszczonego w buforze elucyjnym) wymagane do przetworzenia 1 ml próbek osocza.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Agilent DNA o wysokiej czułości	Agilent Technologies, Inc.	Nr kat. 5067-4626	Testy DNA o wysokiej czułości są często używane do kontroli jakości próbek w bibliotekach sekwencjonowania nowej generacji.
Probówki konserwujące cf-DNA / cf-RNA	Norgen Biotek Corp.	Numer katalogowy: 63950	Probówki konserwujące cf-DNA / cf-RNA firmy Norgen są zamkniętymi, opróżnionymi plastikowymi rurkami do zbierania i konserwacji cfDNA, krążącego DNA guza, cf-RNA i krążących komórek nowotworowych w ludzkich próbkach krwi pełnej podczas przechowywania i transportu
Zestaw krążących kwasów nukleinowych QIAamp	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 55114	Zestaw krążących kwasów nukleinowych QIAamp umożliwia skuteczne oczyszczanie tych krążących kwasów nukleinowych z ludzkiego osocza lub surowicy i innych płynów ustrojowych wolnych od komórek.
Kolektor próżniowy QIAvac 24 Plus	Qiagen powiedział:	Rok 19413	Rozdzielacz próżniowy QIAvac 24 Plus jest przeznaczony do równoległej obróbki próżniowej kolumn QIAGEN.
System łączący QIAvac	Qiagen powiedział:	Rok 19419	W połączeniu z systemem łączącym QIAvac rozdzielacz próżniowy QIAvac 24 Plus może być stosowany jako system przepływowy. Próbka przepływowa, zawierająca potencjalnie zakaźny materiał, jest zbierana do oddzielnej butelki na odpady.
System łączący QIAvac	Qiagen powiedział:	Rok 19419	W połączeniu z systemem łączącym QIAvac rozdzielacz próżniowy QIAvac 24 Plus może być stosowany jako system przepływowy. Próbka przepływowa, zawierająca potencjalnie zakaźny materiał, jest zbierana do oddzielnej butelki na odpady.
rozmaity
Probówki wirówkowe 50 ml
Kruszony lód
Etanol (96–100%)
Blok grzewczy lub podobny w temperaturze 56 °C (może pomieścić 2 ml probówek zbiorczych)
Izopropanol (100%)
Mikrowirówka
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Pipety (regulowane)
Sterylne końcówki do pipet (zaleca się stosowanie końcówek do pipet z barierami aerozolowymi, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu)
Łaźnia wodna lub blok grzewczy o pojemności 50 ml w temperaturze 60 °C