Izolacja krążącego DNA wolnego od komórek (cfDNA): procedura membranowa na bazie krzemionki w celu ekstrakcji cfDNA z osocza krwi pacjentów z rakiem

Streszczenie

Źródło: Palande, V. et al. Wykrywanie bezkomórkowego DNA w próbkach osocza krwi pacjentów z rakiem. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film opisuje procedurę membranową opartą na krzemionce, mającą na celu izolację krążącego wolnego od komórek DNA lub cfDNA z próbki ludzkiego osocza. cfDNA jest obiecującym biomarkerem do diagnozowania i oceny raka.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrostanu ludzi i zostały zweryfikowane przez lokalną instytucjonalną komisję rewizyjną.

1. Oczyszczanie krążącego cfDNA z 1 ml osocza

UWAGA: Ten krok jest wykonywany za pomocą zestawu komercyjnego (patrz Tabela materiałów). Wszystkie zderzaki są dostarczane z zestawem.

1. Przygotowanie i odczynników
   ostrożność: Nie dodawać kwaśnych roztworów ani wybielaczy bezpośrednio do odpadów z przygotowania próbki. Sole guanidyny obecne w buforze do lizy, buforz....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw Agilent DNA o wysokiej czułości	Agilent Technologies, Inc.	Nr kat. 5067-4626	Testy DNA o wysokiej czułości są często używane do kontroli jakości próbek w bibliotekach sekwencjonowania nowej generacji.
Probówki konserwujące cf-DNA / cf-RNA	Norgen Biotek Corp.	Numer katalogowy: 63950	Probówki konserwujące cf-DNA / cf-RNA firmy Norgen są zamkniętymi, opróżnionymi plastikowymi rurkami do zbierania i konserwacji cfDNA, krążącego DNA guza, cf-RNA i krążących komórek nowotworowych w ludzkich próbkach krwi pełnej podczas przechowywania i transportu
Zestaw krążących kwasów nukleinowych QIAamp	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 55114	Zestaw krążących kwasów nukleinowych QIAamp umożliwia skuteczne oczyszczanie tych krążących kwasów nukleinowych z ludzkiego osocza lub surowicy i innych płynów ustrojowych wolnych od komórek.
Kolektor próżniowy QIAvac 24 Plus	Qiagen powiedział:	Rok 19413	Rozdzielacz próżniowy QIAvac 24 Plus jest przeznaczony do równoległej obróbki próżniowej kolumn QIAGEN.
System łączący QIAvac	Qiagen powiedział:	Rok 19419	W połączeniu z systemem łączącym QIAvac rozdzielacz próżniowy QIAvac 24 Plus może być stosowany jako system przepływowy. Próbka przepływowa, zawierająca potencjalnie zakaźny materiał, jest zbierana do oddzielnej butelki na odpady.
System łączący QIAvac	Qiagen powiedział:	Rok 19419	W połączeniu z systemem łączącym QIAvac rozdzielacz próżniowy QIAvac 24 Plus może być stosowany jako system przepływowy. Próbka przepływowa, zawierająca potencjalnie zakaźny materiał, jest zbierana do oddzielnej butelki na odpady.
rozmaity
Probówki wirówkowe 50 ml
Kruszony lód
Etanol (96–100%)
Blok grzewczy lub podobny w temperaturze 56 °C (może pomieścić 2 ml probówek zbiorczych)
Izopropanol (100%)
Mikrowirówka
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Pipety (regulowane)
Sterylne końcówki do pipet (zaleca się stosowanie końcówek do pipet z barierami aerozolowymi, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu)
Łaźnia wodna lub blok grzewczy o pojemności 50 ml w temperaturze 60 °C