Zautomatyzowana analiza rozkładu wielkości fragmentów cfDNA oparta na elektroforezie kapilarnej: metoda oparta na mikroprocesorze DNA do badania rozkładu wielkości fragmentów DNA wyizolowanych z płynów biologicznych

Streszczenie

Źródło: Palande, V. et al. Wykrywanie bezkomórkowego DNA w próbkach osocza krwi pacjentów z rakiem. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie analizujemy rozkład wielkości bezkomórkowego DNA lub fragmentów cfDNA za pomocą automatycznej elektroforezy kapilarnej. Technika ta pomaga uzyskać wgląd w profil fragmentów DNA uwalnianych przez komórki nowotworowe podczas apoptozy.

Protokół

1. Rozkład wielkości fragmentu DNA cfDNA według analizatora fragmentów

1. Etap poprzedzający rozpoczęcie zabiegu: Równowaga koncentratu barwnika DNA i matrycy żelu DNA do temperatury pokojowej przez 30 minut.
2. Przygotowanie mieszanki żelowo-barwnikowej
   nuta: Z roztworami należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ DMSO jest znane z tego, że ułatwia wnikanie cząsteczek organicznych do tkanek.
   1. Dokładnie rozmrozić DMSO poprzez wirowanie fiolki z koncentratem barwnika DNA przez 10 s. Odpipetować 15 μl tego koncentratu do fiolki z matrycą żelu DNA i przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.
   Ponownie obracaj
   2. zakorkowaną fiolkę przez 10 sekund, aż pojawi się efekt mieszania żelu i barwnika.
   3. Wlej mieszaninę na filtr wirowy do górnego naczynia.
   4. Mikrowirować filtr wirowy przy 2 240 x g ± 20% przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   5. Oznacz przygotowany barwnik żelowy w probówce i wyrzuć filtr, zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Oznaczyć probówkę i zapisać datę przygotowania.
      nuta: Filtrat należy wyrzucić zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Mieszanka żelowo-barwnikowa może być używana do 5 chipów DNA o wysokiej czułości (HS). W przypadku nieużywania przez ponad 1 godzinę przechowywać w temperaturze 4 °C. Przechowywanie w ciemności jest możliwe do 6 tygodni.
3. Aby załadować mieszankę żelowo-barwnikową, upewnij się, że płyta podstawy stacji zalewania wiórów jest w odpowiednim położeniu i wyreguluj klips w najniższej pozycji.
   1. Równoważ mieszankę żelu i barwnika do temperatury pokojowej przez 30 minut, monitorując ekspozycję na światło.
   2. Weź nowy chip HS DNA z szczelnie zamkniętej torebki i umieść go na stacji konfekcjonowania chipów, a następnie usuń 9,0 μl mieszanki żelu i barwnika i dozuj go na dno dołka chipowego, oznaczonego jako "G".
      nuta: Sporządzić mieszaninę żelu i barwnika, unikając gromadzenia się cząstek stałych na dnie fiolki. Podczas dozowania mieszanki żelu i barwnika do dołka HS DNA należy całkowicie włożyć końcówkę pipety, aby zapobiec tworzeniu się dużych pęcherzyków powietrza. Co więcej, dotknięcie pipety na krawędziach studzienki przyniesie słabe wyniki.
   3. Ustawić tłok na 1 ml i zamknąć stację zasysania wiórów. Upewnij się, że blokada zatrzasku klika i ustaw timer na 60 s, następnie naciśnij tłok w dół, aż zostanie przytrzymany przez zacisk, a dokładnie po 60 s zwolnij tłok za pomocą mechanizmu zwalniającego klips
   .
   4. Gdy tłok cofnie się co najmniej do oznaczenia 0,3 ml, odczekaj 5 s, a następnie powoli pociągnij z powrotem do pozycji 1 ml, a następnie otwórz stację zalewania chipów i ponownie usuń 9,0 μl mieszanki żelu i barwnika i dozuj na dno dołka chipa HS DNA, oznaczonego jako "G".
4. Aby załadować marker DNA, należy wsypać 5 μl markera DNA do studzienki, oznaczonej symbolem drabiny. Powtórzyć procedurę dla wszystkich 11 studzienek na próbki.
5. Aby załadować drabinkę i próbki, należy dozować 1 μl drabinki DNA do studzienki, oznaczonej symbolem drabinki, a następnie dodać 1 μl próbki (zużyte studzienki) lub 1 μl markera (nieużywane studzienki) do wszystkich 11 dołków na próbki.
6. Wiruj chip HS DNA przez 60 s z prędkością 2,400 obr./min, umieszczając chip poziomo w adapterze. Upewnij się, że wybrzuszenie, które mocuje chip HS DNA, nie jest uszkodzone podczas wirowania.
7. Aby włożyć chip HS DNA do analizatora fragmentów, otwórz pokrywę i upewnij się, że wkład elektrody jest prawidłowo włożony, a selektor chipa jest ustawiony na "dsHigh Sensitivity DNA" w przyrządzie do analizatora fragmentów.
8. Ostrożnie zamontuj chip HS DNA w pojemniku, który pasuje tylko w jeden sposób, a następnie zamknij pokrywę, upewniając się, że wkład elektrody dokładnie pasuje do dołków chipa HS DNA.
9. Wyświetlacz na ekranie oprogramowania analizatora fragmentów wskazuje włożony chip HS DNA i zamkniętą pokrywę za pomocą ikony chipa w lewym górnym rogu ekranu.
10. Aby rozpocząć uruchamianie chipa HS DNA, wybierz test dsDNA o wysokiej czułości z menu "Test" na ekranie urządzenia, a następnie prawidłowo wypełnij tabelę nazw próbek, wprowadzając informacje, takie jak nazwy próbek i komentarze, a następnie rozpocznij uruchamianie chipa, klikając przycisk "Start" w prawym górnym rogu ekranu.
11. Czyszczenie elektrod po uruchomieniu chipa HS DNA: Natychmiast po zakończeniu testu należy usunąć zużyty chip DNA HS i zutylizować go zgodnie z dobrymi praktykami laboratoryjnymi. Wykonaj następującą procedurę, aby upewnić się, że elektrody są czyste, bez pozostałości po poprzednim teście.
    1. Powoli wlej 350 μl dejonizowanej wody do analizy do jednej z studzienek do czyszczenia elektrod i umieść środek do czyszczenia elektrod w przyrządzie do analizatora fragmentów, otwierając pokrywę, a następnie zamknij pokrywę i odczekaj około 10 sekund.
    2. Wyjmij środek do czyszczenia elektrod, otwierając pokrywę i poczekaj kolejne 10 sekund, aż woda z elektrod wyparuje przed zamknięciem pokrywy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2100 Przyrząd do bioanalizowania	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	System 2100 Bioanalyzer jest uznanym zautomatyzowanym narzędziem do elektroforezy do kontroli jakości próbek biomolekuł.
Regulowany klips do stacji zalewania	Agilent Technologies, Inc.	5042-1398	Stosowany w połączeniu ze strzykawką do wywierania określonego nacisku w celu zalewania wiórów.
Probówki konserwujące cf-DNA / cf-RNA	Norgen Biotek Corp.	Numer katalogowy: 63950	Probówki konserwujące cf-DNA/cf-RNA firmy Norgen są zamkniętymi, opróżnionymi probówkami z tworzywa sztucznego do zbierania i konserwacji cf-DNA, krążącego DNA guza, cf-RNA i krążących komórek nowotworowych w ludzkich próbkach krwi pełnej podczas przechowywania i transportu
Stacja zasysania wiórów	Agilent Technologies, Inc.	5065-4401	Służy do ładowania matrycy żelowej do chipa za pomocą strzykawki dostarczonej z każdym zestawem testowym — używanym do testów RNA, DNA i białek. Zawiera stację zalewową, stoper i 1 klips do strzykawki
Zestaw do czyszczenia elektrod	Agilent Technologies, Inc.	5065-9951	Zapobiega zanieczyszczeniu krzyżowemu. Usuwa zanieczyszczenia bakteryjne lub białkowe z elektrod.
Filtry do matrycy żelowej	Agilent Technologies, Inc.	Numer katalogowy: 185-5990	Służy do prawidłowego mieszania koncentratu barwnika DNA i matrycy żelowej DNA
IKA Basic Chip Vortex	IKA-Werke GmbH & Co. KG	Przekaźnik MS-3-S36	Służy do prawidłowego mieszania drabiny DNA i próbki DNA na chipach testowych Bioanalyzer
Probówki wirówkowe o pojemności 50 ml
Etanol (96–100%)
Blok grzewczy lub podobny w temperaturze 56 °C (może pomieścić 2 ml probówek zbiorczych)
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)
Pipety (regulowane)
Sterylne końcówki do pipet (zaleca się stosowanie końcówek do pipet z barierami aerozolowymi, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu)
Łaźnia wodna lub blok grzewczy o pojemności 50 ml w temperaturze 60 °C