Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

Streszczenie

Źródło: Bonner, E. R. et al. Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Protokół

1. Wykrywanie i kwantyfikacja docelowego DNA za pomocą dPCR

1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną dPCR na 8 dołków probówki paskowej do PCR plus 10% ekstra, dodając 220 μl głównej mieszanki genotypowania, po 8,8 μl 10 μM sond typu dzikiego i zmutowanego, 39,6 μl po 10 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 17,6 μl oleju stabilizującego kropelki.
2. Delikatnie wymieszaj mieszaninę reakcyjną dPCR, pipetując pełną objętość w górę i w dół 10–20 razy. Nie wirować ani nie wirować po dodaniu do mieszaniny reakcyjnej oleju stabilizującego kropelki.
3. Zaopatrzyć się w 8-dołkową probówkę z paskiem do PCR i dozować 38 μl mieszaniny reakcyjnej ....

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw materiałów eksploatacyjnych Raindance	Bio-Rad	20-04411	Zawiera chipy do przyrządów generujących kropelki, chipy do przyrządów do oznaczania ilościowego, nasadki paskowe do PCR, w tym nasadki o dużej prędkości, oraz olej stabilizujący kropelki
Instrument Raindance Sense	Bio-Rad		Instrument do kwantyfikacji
Instrument źródłowy Raindance	Bio-Rad		Przyrząd do generowania kropel
Oprogramowanie RainDrop Analyst II	Technologie RainDance		Oprogramowanie analityczne wykorzystywane do analizy danych
Mieszalnik termiczny C	Eppendorf	14 285 562PM
Cykler termiczny MiniAmp	Thermofisher Naukowy	A37834 (wersja
Nasadki do probówek paskowych 8-dołkowych do PCR	Firma VWR	Numer katalogowy: 10011-786
8-dołkowe probówki paskowe do PCR	Axygen (Axigen	PCR-0208-C
Q5 Gorący start High-Fidelity 2x Master Mix	Nowa Anglia Biolabs Inc	Zobacz materiał M0494S

powiedział: angielska) )