Kropelkowa cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy: metoda generowania reakcji PCR nanokropelkowych w celu wykrywania rzadkich mutacji nowotworowych

Streszczenie

Źródło: Bonner, E. R. et al. Wykrywanie i monitorowanie krążącego DNA związanego z nowotworem w płynach biologicznych pacjenta. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie prezentujemy krok po kroku procedurę generowania emulgowanych nanokropelek do wykrywania docelowych kwasów nukleinowych za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy lub dPCR.

Protokół

1. Wykrywanie i kwantyfikacja docelowego DNA za pomocą dPCR

1. Przygotuj mieszaninę reakcyjną dPCR na 8 dołków probówki paskowej do PCR plus 10% ekstra, dodając 220 μl głównej mieszanki genotypowania, po 8,8 μl 10 μM sond typu dzikiego i zmutowanego, 39,6 μl po 10 μM starterów do przodu i do tyłu oraz 17,6 μl oleju stabilizującego kropelki.
2. Delikatnie wymieszaj mieszaninę reakcyjną dPCR, pipetując pełną objętość w górę i w dół 10–20 razy. Nie wirować ani nie wirować po dodaniu do mieszaniny reakcyjnej oleju stabilizującego kropelki.
3. Zaopatrzyć się w 8-dołkową probówkę z paskiem do PCR i dozować 38 μl mieszaniny reakcyjnej dPCR bezpośrednio na dno każdej studzienki. Usuń wszelkie pęcherzyki za pomocą czystej końcówki pipety.
   UWAGA: Probówki paskowe PCR, które są zablokowane lub ciasno upakowane razem, mogą powodować statyczne ładunki elektryczne, powodując koalescencję i zaszumiony sygnał podczas analizy danych dPCR. Aby tego uniknąć, należy wpakować probówki do oddzielnych worków na zagrożenia biologiczne, unikać nadmiernego pakowania worków i nie dopuszczać do ocierania się rurek o siebie.
4. Dodać 12 μl wstępnie amplifikowanej próbki DNA do odpowiednich dołków probówki paskowej do PCR. Do kontroli ujemnej dodać 12 μl MB H₂O.
   UWAGA: Analizuj próbki cfDNA w dołkach replikowanych. W przypadku płynu mózgowo-rdzeniowego należy przeanalizować co najmniej dwukrotnie, a w przypadku osocza/surowicy każdą próbkę przeanalizować trzykrotnie.
5. Delikatnie odpipetować pełną objętość w górę i w dół 10 razy, aby wymieszać mieszaninę reakcyjną z próbką DNA.
6. Zaopatrzyć się w nowy chip przyrządu do wytwarzania kropelek i odpipetować całą objętość z dołków 1–8 probówki paskowej do PCR do odpowiednich kanałów A–H w chipie. Unikaj dotykania dna kanałów końcówką pipety.
7. Zaopatrzyć się w nową, czystą probówkę z paskiem do PCR i włożyć do przyrządu do wytwarzania kropel. Zeskanuj lub ręcznie wprowadź identyfikator chipa przyrządu generującego kropelki do oprogramowania na komputerze urządzenia. Wprowadź nazwy dla każdego z 8 kanałów. Kliknij przycisk Rozpocznij przebieg, aby rozpocząć osadzanie próbek.
8. Po zakończeniu kropelki wyjmij probówkę z paskiem PCR i nałóż nakrętki z probówką z paskiem.
9. Przenieś probówkę z paskiem do termocyklera i zrównoważyć z inną probówką paskową zawierającą 80 μl wody na studzienkę.
10. Zaprogramuj warunki cykli termicznych jako: 95 °C przez 10 minut; 45 cykli dwóch temperatur: 95 °C przez 30 s i temperatury wyżarzania przez 2 minuty; 98 °C przez 10 minut; i utrzymuj w temperaturze 10 °C.
    1. Ustawić szybkość narastania na 0,5 °C/s i ustawić objętość próbki na 80 μl.
11. Po zakończeniu cykli termicznych wyjmij rurkę paskową i przenieś do przyrządu do oznaczania ilościowego. Usuń nakrętki pasków PCR i zastąp je nasadkami o dużej prędkości.
12. Włącz przyrząd do oznaczania ilościowego i podłączony komputer z oprogramowaniem przyrządu. Uruchom oprogramowanie instrumentu i kliknij przycisk Setup a run.
13. Umieścić probówkę z paskiem w przyrządzie do oznaczania ilościowego.
14. Uzyskaj nowy chip do przyrządu do oznaczania ilościowego i zeskanuj lub ręcznie wprowadź identyfikator chipa do urządzenia. Włóż chip do maszyny.
15. Umieść metalową osłonę na chipie i zamknij pokrywę instrumentu.
16. W oprogramowaniu komputerowym wprowadź nazwę przebiegu dPCR i każdego z 8 kanałów (A–H). Wybierz tryb szybki (który musi być używany z nasadkami o dużej prędkości) i kliknij przycisk Start, aby rozpocząć kwantyfikację.
17. Po zakończeniu oznaczania ilościowego usuń metalową osłonę (do zachowania i ponownego użycia) i wyrzuć probówkę z paskiem PCR i chip. Na komputerze instrumentu dziennik uruchamiania będzie zawierał pliki wyników dla każdego przebiegu. Użyj plików .fcs dla każdej próbki, aby przeprowadzić analizę za pomocą oprogramowania analitycznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw materiałów eksploatacyjnych Raindance	Bio-Rad	20-04411	Zawiera chipy do przyrządów generujących kropelki, chipy do przyrządów do oznaczania ilościowego, nasadki paskowe do PCR, w tym nasadki o dużej prędkości, oraz olej stabilizujący kropelki
Instrument Raindance Sense	Bio-Rad		Instrument do kwantyfikacji
Instrument źródłowy Raindance	Bio-Rad		Przyrząd do generowania kropel
Oprogramowanie RainDrop Analyst II	Technologie RainDance		Oprogramowanie analityczne wykorzystywane do analizy danych
Mieszalnik termiczny C	Eppendorf	14 285 562PM
Cykler termiczny MiniAmp	Thermofisher Naukowy	A37834 (wersja
Nasadki do probówek paskowych 8-dołkowych do PCR	Firma VWR	Numer katalogowy: 10011-786
8-dołkowe probówki paskowe do PCR	Axygen (Axigen	PCR-0208-C
Q5 Gorący start High-Fidelity 2x Master Mix	Nowa Anglia Biolabs Inc	Zobacz materiał M0494S