Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Resekcja pod kontrolą fluorescencji i implantacja rusztowania
UWAGA: Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed rozpoczęciem operacji.
- Umieść ramkę stereotaktyczną na stoliku fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego.
- Znieczulić mysz pod wpływem wdychanego izofluranu w komorze indukcyjnej. Po znieczuleniu zabezpiecz mysz w ramce stereotaktycznej za pomocą ciągłego dopływu znieczulenia wziewnego za pomocą adaptera stożka nosowego z izofluranem. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej i/lub sondy.
UWAGA: 4–5% izofluranu nadaje się do indukcji, a 2–3% do konserwacji, ale należy to dostosować i monitorować dla każdej myszy.
- Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Wysterylizuj miejsce nacięcia skóry głowy serią trzech chusteczek nasączonych alkoholem i trzema chusteczkami betadynowymi.
- Wykonaj test odruchu szczypania palców u nóg na każdej kończynie i potwierdź negatywną odpowiedź, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie. Zapewnić stałą częstość oddechów na poziomie około 55–65 oddechów/min.
- Za pomocą kleszczy uszczypnij i delikatnie unieś skórę głowy. Wykonaj liniowe nacięcie rostralno-ogonowe w linii środkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przepłukać miejsce nacięcia PBS i usunąć tłuszcz podskórny za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką okrężnym ruchem szczotkowania. Ułóż skórę tak, aby wcześniej ustalone okno czaszki było w pełni widoczne.
- Delikatnie nakłuj oponę twardą tuż po wewnętrznej stronie do granic okna czaszki za pomocą igły 18G. Powtarzaj, aż nacięcie w pełni obejmie wnętrze okna.
- Usuń oponę twardą, odrywając ją za pomocą cienkich kleszczy, odsłaniając leżący pod spodem miąższ i guz.
- Zlokalizuj guz U87 mCh-Fl, wyłączając światła w pomieszczeniu i włączając tryb fluorescencji stereomikroskopu. Przygotuj się do resekcji, wkładając końcówkę pipety o pojemności 1–200 μl do końca rurki pompy próżniowej.
- Włącz pompę próżniową. Wyciąć guz, delikatnie odsysając tkankę fluorescencyjną, aż nie pozostanie żaden sygnał. Wyłącz pompę próżniową i wyrzuć końcówkę pipety. Wyłącz fluorescencję, a światła w pomieszczeniu włącz ponownie.
UWAGA: Aby zatamować krwawienie, przetrzymuj zimnym PBS i wywieraj stały nacisk za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. W cięższych przypadkach jama resekcyjna może być również tymczasowo wypełniona środkiem hemostatycznym, o ile zostanie on usunięty po ustaniu krwawienia, a następnie ponownie irygowany PBS.
- Bezpośrednio przed implantacją należy powoli zanurzyć rusztowanie PLA z nasionami MSC w PBS, aby usunąć niechciane podłoże i powiązane komponenty. Wszczepić rusztowanie do jamy resekcyjnej. W razie potrzeby dodaj 1 μl fibrynogenu (67–106 mg/ml), a następnie 1 μl trombiny (400–625 U/ml), aby zabezpieczyć rusztowanie na miejscu.
- Po usunięciu opony twardej i wyrzuceniu płata kostnego z okienka czaszki, należy uszczelnić ranę, po prostu zamykając skórę i nakładając klej chirurgiczny. Wyjmij zwierzę ze znieczulenia wziewnego i pozostaw do odzyskania na rozgrzanej powierzchni.
