Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Znakowanie komórek glejaka za pomocą konstruktu FP635 lub FP720
- Produkcja i oczyszczanie lentiwirusa zgodnie z protokołem opisanym poniżej:
- Obserwuj potrawy zasiane w dniu 1. Gdy komórki zlewają się w 80–90%, są gotowe do transfekcji.
UWAGA: Komórki powinny nadal mieć miejsce na przejście 1-2 podziałów komórkowych
- Przygotować mieszaninę plazmidów, dzieląc cztery plazmidy do probówki o pojemności 50 ml. Do przygotowania płytki o długości 12 × 15 cm należy użyć 270 μg wektora przenoszenia, 176 μg pMDL (Gag/Pol), 95 μg pVSVG (glikoproteiny wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej) i 68 μg pREV.
- Przygotować 13,5 ml 0,25 M CaCl2 (rozcieńczyć przefiltrowanym ddH2O) i dodać do mieszaniny plazmidów. Dodać 13,5 ml 2× roztworu BBS. Delikatnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej (22–26°).
- Dodać mieszaninę transfekcji (rozprowadzając w kroplach) do każdej płytki (2,25 ml na płytkę). Delikatnie zamieszać płytki i inkubować w temperaturze 3% CO2 w temperaturze 37 °C przez noc (16–20 godzin).
- Obserwuj komórki. Powinny zbliżać się do zbieżności. Jeśli w plazmidzie lentiwektorowym obecny jest widoczny marker (taki jak GFP), skuteczność transfekcji można ocenić wizualnie. Idealnie, wydajność transfekcji powinna wynosić >90%.
- Usuń pożywkę, dodaj 15 ml świeżego DMEM + 2% FBS do każdego naczynia i przenieś do 10% CO2, 37 °C. Inkubować przez noc.
- Zbierz pierwszy zbiór supernatantu: Zbierz i połącz supernatant (12 szalek × 15 ml/naczynie = 180 ml) z szalek.
- Dodaj 15 ml świeżego DMEM + 2% FBS do każdego dania. Inkubować naczynia w temperaturze 10% CO2, 37 °C przez noc. Naczynie zawierające supernatant lentiwirusowy należy umieścić w wtórnym zbiorniku (wystarczy szczelnie zamknięta plastikowa torba) i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Zagęścić preparat wirusowy: Zagęścić cząsteczki wirusa przez ultrawirowanie. Odwirować supernatant przy 70 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 20 °C. Zaleca się stosowanie rurek stożkowych (w przeciwieństwie do rur z okrągłym dnem) i wahliwych wirników kubełkowych (w przeciwieństwie do wirników o stałym kącie nachylenia) (po prostu dlatego, że ta kombinacja sprawia, że prawie niewidoczne osady są łatwiejsze do zlokalizowania). Używamy probówek stożkowych z wirnikiem Beckman SW28 (pojemność na sześć probówek) przy 19 400 obr./min przez 2 godziny w temperaturze 20 °C. Napełnij probówki 30 ml supernatantu. Całkowita objętość supernatantu z naczynia o długości 12 × 15 cm wynosi 360 ml; Dlatego przetworzenie pełnej objętości będzie wymagało dwóch kolejnych obrotów. Załaduj probówki, wykonaj pierwsze wirowanie, wylej supernatant bez naruszania osadu, ponownie załaduj świeży supernatant wirusowy i przeprowadź drugi wir
.
- Odlej sklarowany osad i pozwól, aby pozostały płyn spłynął, opierając odwrócone rurki na ręcznikach papierowych. Odsysać pozostałe kropelki za pomocą aspiratora, aby usunąć cały płyn z osadu. Granulka powinna być ledwo widoczna jako mała półprzezroczysta plamka.
- Zawiesić granulki wirusa w 100 μl 1× HBSS. Unikaj spieniania. Przepłukać probówki 100 μl 1× HBSS. Połączyć obie objętości, aby uzyskać 200 μl końcowej objętości.
- Przenieść do zakręcanej probówki do mikrofuge, zawinąć w parafilm i wirować na niskich obrotach przez 15–30 minut. Zawieszony preparat wirusowy będzie wyglądał od klarownego do lekko mlecznego.
- Usunąć zawiesinę, obracając ją przez 10 s na mikrowirówce stołowej. Przenieść supernatant do świeżej probówki do mikrofuge z nakrętką. Przygotować 20 μl porcji supernatantu. Ten wirusowy supernatant ma jakość in vitro.
- Hodowla około 2,0 x 106 komórek z ludzkiej linii komórkowej glejaka z DMEM plus 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w naczyniu o średnicy 15 cm; lub hodowla 2,0 x 106 sfer pochodzących od pacjentów z glejakiem ludzkim (GBM-PDX) z pożywką DMEM/F12 1:1 z suplementem B27 plus ludzkim rekombinowanym naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF; 20 ng / ml) i FGF (10 ng / ml) w kolbie T75.
- Utrzymuj wszystkie komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 100% wilgotności względnej.
- Oddziel komórki.
- W przypadku komórek glejaka: usuń supernatant z płytek i dodaj 3-5 ml trypsyny 1X do komórek glejaka.
- W przypadku kulek GBM: zebrać komórki, pipetując je do probówki o pojemności 15 ml.
- Wirować kulki GBM przy 200 x g przez 5 minut za pomocą wirówki stołowej w temperaturze pokojowej.
- Usuń supernatant i dodaj 3–5 ml roztworu do oddzielania komórek.
- Inkubować wszystkie komórki w temperaturze 37 °C przez 10–15 minut.
- Ostrożnie rozdzielić komórki, pipetując kilkakrotnie w górę i w dół (upewnić się, że kulki i komórki glejaka są całkowicie zdysocjowane) i wirować w dół z prędkością 200 x g przez 5 minut.
- Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 5 ml pożywki, kilkakrotnie pipetując w górę i w dół. Określ żywotność komórek przez wykluczenie błękitu trypanowego.
- Płytka 1,0 x 106 komórek docelowych w 10 cm naczyniu z 5 ml pożywki przez pipetowanie.
- Transdukować komórki z lentiwirusem wykazującymi ekspresję białek fluorescencyjnych przy wielokrotności infekcji (MOI) 5 i inkubować w temperaturze 37 °C.
- Po 24 godzinach usunąć pożywkę z transdukowanych komórek, dodać 5 ml świeżej pożywki i inkubować przez dodatkowe 48 godzin w temperaturze 37 °C.
- Zdysocjuj zakażone komórki do zawiesiny jednokomórkowej za pomocą trypsyny, jak opisano powyżej. Odwirować komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w 500 μl roztworu sortującego (sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) z 1% FBS).
- Odpipetować zawiesinę komórek do probówek FACS. Wybarwić komórki 1 μl/ml dichlorowodorku 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI), aby wykluczyć martwe komórki. Kontrole ujemne są wymagane do ustawienia bramek cytometru przepływowego (komórki nietransdukowane i komórki nietransdukowane/barwione DAPI).
- Posortuj komórki fluorescencyjno-dodatnie/DAPI-ujemne do roztworu sortującego i zbierz posortowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
- Odwirowywać posortowane komórki w ilości 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 5 ml pożywki hodowlanej. Posortowane komórki umieścić w 10-centymetrowym naczyniu, pipetując. Inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 48–72 godziny.
- Rozwiń posortowane komórki, dysocjując komórki, jak opisano powyżej, i posiejąc je w wielu szalkach do eksperymentów in vivo.