Fluorescencyjna tomografia molekularna: technika obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem fluorescencyjnym w modelu mysim

Streszczenie

Źródło: Benitez, J. A. et al., Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie opisujemy fluorescencyjną tomografię molekularną lub FMT do obrazowania in vivo fluorescencyjnych ksenoprzeszczepów glejaka znakowanego białkiem w modelach mysich. Technika ta jest przydatna do wyjaśnienia efektów terapii przeciwnowotworowych na poziomie molekularnym.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1.Obrazowanie FMT

UWAGA: Zgodnie z celem eksperymentu, komórki glejaka oznaczone iRFP mogą być monitorowane in vivo przed, w trakcie lub po leczeniu. W celu obrazowania należy znieczulić zwierzęta za pomocą komory indukcyjnej izofluranu, utrzymać w kasecie obrazowania podczas skanowania i zobrazować w stacji dokującej imagera FMT.

1. Wyjąć zwierzę z klatki i umieścić je w komorze indukcyjnej izofluranu. Zamknij komorę i włącz przepływ tlenu i parownik na 3–5%.
2. Monitoruj zwierzę aż do całkowitego znieczulenia, zwykle w ciągu 1-2 minut. Nieprzytomne zwierzęta nie powinny reagować na bodźce zewnętrzne.
3. Wyjmij znieczulone zwierzę z komory i umieść je w kasecie obrazowania, umieszczając najpierw adapter głowy, a następnie kładąc zwierzę przodem do dołu. Upewnij się, że głowica znajduje się na środku kasety.
4. Umieść górną płytę kasety na górze i dokręć pokrętła regulacyjne do 17 mm.
5. Gdy zwierzę zostanie zabezpieczone w kasecie do obrazowania, przystąp do obrazowania, wkładając kasetę do wewnętrznej stacji dokującej kamery FMT, gdzie izofluran jest pompowany, aby utrzymać zwierzę w stanie znieczulenia.
6. Uruchom oprogramowanie imagera i analizatora, klikając dwukrotnie ikonę oprogramowania.
7. W oknie "Eksperymentalne" wybierz "Baza danych" i "Grupa badawcza".
8. Przejdź do zakładki "Skanuj" i wybierz temat do obrazu, klikając "wybierz temat". Wybierz także kanał laserowy w panelu "Kanał laserowy". W przypadku ogniw oznaczonych FP635 wybierz "kanał laserowy 635 nm", a w przypadku ogniw oznaczonych FP720 wybierz "kanał laserowy 680 nm".
9. Uzyskaj obraz, klikając opcję "Przechwyć" w oknie "Karta Skanuj". Następnie dostosuj pole skanowania, klikając i przeciągając pole skanowania na przechwyconym obrazie do określonej liczby lokalizacji źródłowych, zwykle w zakresie 20–25 źródeł po stronie ipsilateralnej.
10. Zaznacz opcję "Dodaj do kolejki rekonstrukcji" i naciśnij "Skanuj" w oknie "Zakładka Skanuj".
11. Poczekaj na zakończenie skanowania, a następnie wyjmij kasetę z obrazem ze stacji dokującej.
12. Zdejmij górną płytę kasety i umieść zwierzę z powrotem w klatce.
13. Powtórz kroki 1.1–1.12 dla pozostałych zwierząt.

2. Analiza obrazu

1. W oprogramowaniu imagera i analizatora wybierz okno "Karta Analiza".
2. Załaduj zbiór danych i temat do analizy, klikając przycisk "+" w panelu "Wybór zestawu danych" w oknie "Karta Analiza".
3. Po załadowaniu obrazu w oknie "Zakładka Analiza" należy przeprowadzić analizę obszaru zainteresowania (ROI), wybierając ikonę elipsoidy, znajdującą się w lewym górnym rogu okna "Zakładka Analiza".
4. Dostosuj próg do zera w panelu "dane statystyczne", klikając prawym przyciskiem myszy kolumnę "próg" w oknie "zakładka Analiza".
5. Całkowita wartość w panelu "Dane statystyczne" reprezentuje sygnał z komórek glejaka znakowanego fluorescencyjnie wszczepionych do mózgu myszy.
6. Powtórz kroki 2.2–2.4 dla pozostałych zwierząt. Załaduj lub usuń nowy temat, klikając odpowiednio przycisk "+" lub "−" w panelu "Wybór zestawu danych" w oknie "Zakładka Analiza".

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System tomografii fluorescencyjnej	PerkinElmer powiedział:	FMT 2500 XL
Oprogramowanie do obrazowania TrueQuant	Perkin Elmer	7005319
Atymiczne nagie myszy	Laboratoria Charlesa Rivera	Kod szczepu 490 (homozygotyczny)	Uprzednia zgoda Institutional Program Opieki nad Zwierzętami oraz przez Instytucjonalny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Wymagane.