Test migracji komórek macierzystych guza mózgu (BTSC) do badań nad leczeniem farmakologicznym: technika obrazowania żywych komórek in vitro w celu analizy wpływu leczenia farmakologicznego na migrację BTSC

Streszczenie

Źródło: Restall, I. et al. Testy obrazowania żywych komórek do badania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka, guza mózgu. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie przeprowadzamy test migracji komórek macierzystych guza mózgu, aby przeanalizować wpływ interesującego leku na migrację żywych komórek macierzystych guza mózgu za pomocą płytki migracyjnej chemotaksji. Obrazowanie żywych komórek ułatwia wizualizację i ilościowe określenie migracji komórek podczas testu.

Protokół

1. Test migracji komórek macierzystych guza mózgu

1. Wysiewaj 200 000 komórek w kolbie T25 w 8 ml kompletnej pożywki na 1–2 tygodnie przed planowanym wykonaniem testu migracji.
   nuta: Czas między posiewem a wykonaniem testu będzie się różnić w zależności od tempa wzrostu użytej kultury BTSC.
   1. Aby przetestować wpływ leczenia farmakologicznego na migrację, należy wstępnie potraktować komórki odpowiednim nośnikiem, takim jak DMSO, i lekiem będącym przedmiotem zainteresowania, dodając odpowiednie objętości nośnika lub zapasu leku bezpośrednio do oddzielnych studzienek pożywki zawierającej komórki.
2. Przygotuj płytkę migracyjną chemotaksji (ryc. 1A), pokrywając ją cienką warstwą kolagenu.
   1. Oblicz liczbę dołków 96-dołkowej płytki chemotaksji, które będą musiały zostać pokryte kolagenem. Należy uwzględnić co najmniej trzy studzienki replikacji dla każdego warunku.
   2. Rozcieńczyć 5 mg/ml wywaru kolagenu typu I do 0,2 mg/ml w czystym kwasie octowym rozcieńczonym do 0,14% w wodzie klasy hodowlanej.
   3. Odpipetować 0,2 mg/ml kolagenu zarówno do studzienek wkładu membranowego, jak i do studzienek dolnego zbiornika, które są używane.
      nuta: Zbiorniki denne płytki wymagają 225 μl, a studzienki wkładu membranowego wymagają 75 μl kolagenu do prawidłowego powlekania.
   4. Umieścić płytkę migracyjną w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Odessać roztwór kolagenu ze studzienek, nie rysując powłoki kolagenowej.
   5. Umyj studzienki 2x sterylnym 1x PBS. Jeśli płytka nie jest używana od razu, należy zassać PBS i przechowywać ją w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Przed użyciem ogrzej płytkę migracyjną chemotaksji do temperatury pokojowej.
3. Przygotować dolny zbiornik płytki migracyjnej chemotaksji.
   1. Odpipetować 225 μL pożywki (bez czynników wzrostu), uzupełnionej 10% FBS jako chemoatraktantem, do dennych studzienek zbiornikowych płytki migracyjnej chemotaksji.
   2. Delikatnie umieść wkład membranowy w dolnym zbiorniku pod kątem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
4. Umieść komórki we wkładce membranowej płytki migracyjnej chemotaksji.
   1. Ponownie zawiesić zdysocjowane BTSC w pożywkach (bez czynników wzrostu) przy gęstości komórek 50 000 komórek/ml. Dodaj leki do pożywki, jeśli oceniasz migrację podczas różnych terapii odwykowych. Alternatywnie, wysiewaj równą liczbę komórek poddanych działaniu środka i komórek kontrolnych, zachowując końcowe stężenie leku podczas posiewu.
   2. Wprowadzić 50 μl BTSC z kroku 1.4.1 do każdej studzienki płytki migracyjnej w żądanych warunkach uzdatniania.
5. Wyobraź sobie migrację chemotaksji.
   1. Umieść płytkę migracyjną chemotaksji w systemie obrazowania żywych komórek i ustaw oprogramowanie do automatycznego obrazowania tak, aby uzyskiwało obrazy mikroskopowe płytki co 1–2 godziny przez okres do 72 godzin. Korzystając z komercyjnego oprogramowania (patrz Spis materiałów), kliknij prawym przyciskiem myszy na osi czasu i ustaw interwał skanowania na co 2 godziny dla 24 h.
      nuta: Przedział czasowy i całkowity czas, który upłynął, będą się różnić w zależności od użytych kultur BTSC; Rozpoczynać w odstępach 2-godzinnych przez 72 godziny, aż do zdobycia doświadczenia z poszczególnymi kulturami BTSC. Jeśli zautomatyzowany system obrazowania jest niedostępny, obrazy o tym samym polu widzenia można uzyskać ręcznie za pomocą mikroskopu i kamery podłączonej do oprogramowania do obrazowania.
   2. Po zakończeniu akwizycji obrazu uzyskaj obrazy dla całego eksperymentu i utwórz definicję przetwarzania za pomocą oprogramowania analitycznego, które odróżnia komórki od tła błony i porów migracyjnych (ryc. 1B, czerwona maska). Korzystając z komercyjnego oprogramowania (patrz Tabela materiałów), wybierz nową definicję przetwarzania i ustaw ustawienia definicji przetwarzania dla BTSC na próg początkowy 52, próg wzrostu 85, dostosowanie rozmiaru (pikseli) o -1 i minimalny obszar 200 μm². Zastosuj tę definicję przetwarzania do dolnej strony membrany. Zmodyfikuj tę analizę, jeśli nie odróżnia ona dokładnie komórek od błony tła.
   3. Zbierz dane jako obszar powierzchni komórki na dolnej stronie błony dla każdej z trzech studzienek replikacji, które zliczają tylko komórki, które migrowały przez pory. Wykres migracji komórek w μm² (obszar migrowanych komórek) w czasie (rysunek 1C).
      nuta: Upewnij się, że względna liczba komórek posianych i policzonych na górnej powierzchni membrany w pierwszym punkcie czasowym jest podobna (mniej niż 20% odchylenia we wszystkich studzienkach) we wszystkich warunkach obróbki, aby uniknąć jakichkolwiek skutków nierównomiernego posiewu. Zbieranie danych za pomocą komercyjnego oprogramowania (patrz tabela materiałów) można przeprowadzić poprzez uruchomienie definicji przetwarzania utworzonej w kroku 1.5.2, kliknięcie na Metryki, następnie na Wykres/eksport, a następnie na Eksport danych.

Wyniki

Rycina 1: Obrazowanie żywej komórki migracji BTSC. (A) Jest to przykład 96-dołkowej płytki migracyjnej chemotaksji pokrytej cienką warstwą kolagenu typu I przed wykonaniem testu migracji za pomocą BTSC. Obrazy pokazują i) płytkę ze wszystkimi trzema częściami (pokrywą, wkładką membrany i zbiornikiem) umieszczonymi razem, ii) wszystkie trzy części są oddzielone, iii)...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Macierz macierzy	Corning	Numer katalogowy: 356230
Płytki 96-dołkowe	Eppendorf	30730119
T25 Nunc EasYFlask	Rybak termiczny	156367
Falcon 15 ml rurka stożkowa	Rybak termiczny	352096
Incucyte ClearView 96-dołkowa płytka chemotaksji	Nauki biologiczne w Essen	4582
System analizy żywych komórek IncuCyte Zoom	Nauki biologiczne w Essen	Numer katalogowy: 4545
Oprogramowanie do analizy żywych komórek IncuCyte Zoom	Nauki biologiczne w Essen	2016A Rev1
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma	Zobacz materiał D8537
Woda klasy kulturowej	Lonza BioWhittaker	17-724Q
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	Invitrogen	Numer katalogowy 12483-020
Kolagen szczurzy I	Trevigen	3440-100-01
Rozwiązanie do odłączania ogniw Accumax	Innowacyjne technologie komórkowe	Zobacz materiał AM105

powiedział: SZT. powiedział: