1. Test inwazji neurosfery komórek macierzystych guza mózgu
- Wysiewaj 200 000 komórek w 8 ml kompletnej pożywki w kolbie T25 na 1–2 tygodnie przed planowanym wykonaniem testu inwazji.
nuta: Czas od posiewu do wykonania testu będzie zależał od tempa proliferacji zastosowanej kultury BTSC.
- W przypadku komórek poddanych wstępnej obróbce, dodaj interesujący nas związek do kolby w żądanym stężeniu przez z góry określony czas, zanim neurosfery będą gotowe do posiewu do inwazji.
- Poczekaj, aż średni rozmiar neurosfery wyniesie około 150–200 μm; zazwyczaj zajmuje to 7–14 dni, w zależności od używanej kultury BTSC.
nuta: Typowe jest obserwowanie rozkładu rozmiarów kulek w kolbie.
- Przechylić i delikatnie wymieszać kolbę pipetą i przenieść 500 μl neurosfer BTSC do stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml dla każdego warunku leczenia; zostanie ona wykorzystana do płytki trzech powtórzonych studzienek.
UWAGA: Kroki 1.3.1–1.3.2 są opcjonalne, ale zalecane dla pierwszego eksperymentu z inwazją na nowej kulturze BTSC.
- Aby określić gęstość neurosfer, które trafią do studni, przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml, jak w kroku 1.3. Delikatnie wymieszaj neurosfery i przenieś 100 μl do oddzielnej 96-dołkowej płytki i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie przez 5 minut.
- Sprawdź liczbę neurosfer pod mikroskopem, aby upewnić się, że wiele neurosfer znajduje się w obszarze studni, który zostanie zobrazowany bez jej przepełnienia.
nuta: Atakujące neurosfery wymagają wystarczająco dużo miejsca, aby potroić swoją średnicę bez interakcji z sąsiednimi neurosferami. Liczbę neurosfer w studzience można dostosować, licząc liczbę neurosfer w studzience i dodając więcej lub mniej neurosfer z kolby T25 do stożkowej rurki o pojemności 1,5 ml w kroku 1.3.
- Umieść stożkową probówkę o pojemności 1,5 ml z komórkami z kroku 1.3 na lodzie i wykonaj kroki 1.5–1.7 na lodzie.
- Pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie na dnie stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml przez 5 minut i wstępnie schłodzić oznakowaną 96-dołkową płytkę na lodzie.
- Ponownie zawiesić neurosfery w białku macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Przygotuj 500 μl 0,4 mg/ml roztworu kolagenu typu I na lodzie dla każdego warunku leczenia: dodać 459 μl pożywki (bez czynników wzrostu), 40 μl roztworu podstawowego kolagenu 5 mg/ml i 0,92 μl sterylnego 1N NaOH (Tabela 1).
UWAGA: Wymagane jest 500 μl roztworu kolagenu na każdy warunek leczenia: 100 μl na każdą z trzech studzienek replikowanych i 200 μl nadmiaru. W tym miejscu należy dodać leczenie farmakologiczne w pożądanym stężeniu końcowym, odjętym od składnika pożywki roztworu. Protokół ten opisuje zastosowanie kolagenu typu I jako białka macierzy zewnątrzkomórkowej; Można jednak przetestować każde białko macierzy zewnątrzkomórkowej. Ponadto w przypadku kultur BTSC, które mają wolniejsze tempo inwazji, czynniki wzrostu lub FBS mogą być uzupełniane w pożywkach w celu zwiększenia szybkości inwazji.
- Po tym, jak neurosfery z kroku 1.5 osiądą, odessaj jak najwięcej pożywki, nie tracąc przy tym pastylki neurosfery, która osiadła na dnie. Delikatnie zawiesić neurosfery w 500 μl roztworu kolagenu przygotowanego w kroku 1.6.1.
- Dodaj 100 μl mieszaniny kolagenu i neurosfery do trzech powtórzonych dołków 96-dołkowej płytki na lodzie. Pozwól neurosferom osiąść na lodzie przez 5 minut.
- Przenieść 96-dołkową płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C na 5 minut, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.
- Natychmiast przygotuj się do zobrazowania 96-dołkowej płytki.
- Umieść 96-dołkową płytkę na tacy systemu obrazowania żywych komórek lub na stoliku mikroskopu, aby uzyskać obraz jako odniesienie dla rozmiaru neurosfery w momencie posiewu, przed rozpoczęciem inwazji.
- Zdjęcia należy wykonywać co godzinę, aż tempo inwazji ustabilizuje się; zazwyczaj dzieje się to w ciągu 24 godzin
nuta: Interwał obrazowania może być modyfikowany w zależności od używanego sprzętu. Interwał obrazowania i całkowity czas, który upłynął, można również modyfikować dla kultur BTSC, które mają różne szybkości inwazji.
- Określ rosnącą powierzchnię BTSC w miarę ich inwazji na matrycę w czasie.
nuta: Powierzchnia komórek w czasie posiewu, obliczona jako średnia z trzech dołków replikowanych, musi być podobna (mniej niż 20% odchylenia we wszystkich studzienkach) między różnymi warunkami obróbki, aby zapewnić, że na różnice w inwazji BTSC nie ma silnego wpływu liczba lub rozmiar platerowanych neurosfer.
- W przypadku systemu analizy żywych komórek należy użyć obiektywu 10X do akwizycji obrazu i uzyskać cztery obrazy na studzienkę dla trzech dołków replikowanych. Aby określić względną powierzchnię komórki, reprezentowaną jako procentowa zbieżność studzienki, należy skonfigurować definicję przetwarzania, która wyraźnie wyróżnia komórki na tle studni. Korzystając z komercyjnego oprogramowania (patrz tabela materiałów), wybierz nową definicję przetwarzania i ustaw korektę segmentacji na 0,8, minimalną powierzchnię na 300 μm2, a maksimum mimośrodu na 0,99. Zmodyfikuj tę analizę, jeśli nie odróżnia ona dokładnie komórek od tła.
nuta: W przypadku stosowania innych metod do obrazowania inwazji neurosfery w czasie, zaleca się uzyskanie wielu pól widzenia dla trzech studni replikowanych w czasie. Jednak nieobrazowanie dokładnie tego samego pola widzenia w każdym interwale zwiększy błąd standardowy zebranych danych. Oprogramowanie komputerowe może być użyte do pomiaru powierzchni atakujących komórek na każdym obrazie.
- Zbierz dane jako całkowitą powierzchnię komórki (względną lub bezwzględną) dla każdej studzienki w każdym punkcie czasowym i określ średnią z trzech studzienek replikowanych. Wykres inwazji BTSC można narysować na wykresie zwiększającego się obszaru komórek w czasie.
szt.
pkt.
TGL
| Przygotowanie roztworu kolagenu |
| Zapas [Kolagen] (mg/mL) | 5 |
| Końcowy [Kolagen] (mg/mL) | 0,4 |
| Liczba potrzebnych studni: | 5 |
| Całkowita objętość (μL) | 500 |
| Objętość kolagenu wyjściowego (μL) | Rozdział 40 |
| Objętość 1N NaOH (μL) | 0,92 |
| Objętość pożywki (μl) | Okręg wyborczy 459 |
Tabela 1: Przygotowanie roztworu kolagenu typu I o stężeniu 0,4 mg/ml. Wymienione są znane początkowe i pożądane stężenia końcowe roztworu kolagenu typu I. Wymienione objętości są wystarczające do umieszczenia neurosfer w trzech dorobkach replikowanych plus dwie na nadmiar i mogą obejmować pojedynczy warunek leczenia, jak opisano szczegółowo w kroku 1 protokołu.
