Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie wzorzystych slajdów
- Przygotowanie podłoża do mikromodelowania
- Szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm należy poddawać aktywacji powietrzem/plazmą przez 5 minut. Umieścić szkiełka nakrywkowe w zamkniętej komorze ze 100 μl (3-aminopropylo)trietoksysilanu w eksykatorze na 1 godzinę.
- Inkubować ze 100 mg/ml walerianianu poli(glikolu etylenowego)-sukcynimidylu (masa cząsteczkowa 5 000 (Peg-SVA)) w 10 mM buforze węglanowym o pH > 8 przez 1 godzinę. Dokładnie spłukać ultraczystą wodą i wysuszyć pod kapturem chemicznym.
nuta: Na tym etapie próbka może być przechowywana w temperaturze 4°C w ciemności do dalszego wykorzystania.
- Dodać fotoinicjator, chlorek 4-benzoilobenzoilotrimetyloamoniowy (PLPP), w stężeniu 14,7 mg/ml w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS).
nuta: Można również stosować skoncentrowaną formę PLPP, żel PLPP. Powoduje to krótszy czas oświetlenia ultrafioletowego (UV) wymagany do degradacji szczotki PEG (100 mJ/mm2).
- Osadzanie żelu fotoinicjatora
- Przygotuj mieszaninę 3 μl żelu PLPP i 50 μl absolutnego etanolu do osadzenia na środku szkiełka. Umieścić próbkę pod osłoną chemiczną aż do całkowitego odparowania absolutnego etanolu.
nuta: Na tym etapie próbka może być przechowywana w temperaturze 4°C w ciemności do dalszego wykorzystania.
- Mikrowzory szkiełek szklanych
- Zamontuj szkiełko nakrywkowe w komorze Ludina i umieść je na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu wyposażonym w system automatycznego ustawiania ostrości.
- Załaduj do oprogramowania obrazy odpowiadające przewidywanym mikrowzorcom. Zastosuj następujące parametry: replikacja 4 x 4 razy, odstęp 200 μm, dawka UV 1 000 mJ/mm2. Po automatycznej sekwencji oświetlenia UV spłucz PLPP wieloma płukaniami PBS.
nuta: Jeśli użyto żelu PLPP, należy go usunąć przez obfite przemycie wodą dejonizowaną, wysuszyć w strumieniuN2 i przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Inkubować z lamininą (50 μg/ml w PBS) przez 30 min. Dokładnie przemyć PBS.
UWAGA: Fluorescencyjny roztwór oczyszczonego białka zielonej fluorescencji (GFP, 10 μg/ml w PBS) można zmieszać z lamininą w celu wizualizacji mikrowzorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
2. Przygotowanie neuronów i komórek GBM do kokultury
- Hodowla embrionalnych neuronów hipokampa szczura
- Rozciąć hipokamp embrionalnych (E18) szczurów i przenieść tkankę do roztworu soli Hanka (HBSS)/1 mM roztworu kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES)/penicyliny-streptomycyny w probówce o pojemności 15 ml. Usuń nadmiar roztworu bez wysuszania hipokampa.
- Dodać 5 ml kwasu tetraoctowego trypsyny-etylenodiaminy (EDTA) uzupełnionego penicyliną (10 000 jednostek/ml)/streptomycyną (10 000 μg/ml) i 1 mM HEPS i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć 2x roztworem HBSS/HEPES/penicylina-streptomycyna i pozostawić tkankę w tym roztworze przez 2–3 minuty.
- Oddziel tkankę za pomocą dwóch wypolerowanych płomieniowo pipet Pasteura, pipetując w górę i w dół 10 razy każdą tkanką, uważając, aby zminimalizować pienienie. Policz komórki i oceń żywotność zawiesiny komórek. Umieść neurony na mikrowzorzystych szkiełkach nakrywkowych, jak pokazano poniżej.
nuta: Wskaźnik żywotności komórek wynosi 85–90% po ekstrakcji.
- Hodowla komórkowa neuronów na mikrowzorzystych szkiełkach nakrywkowych
- Uwodnić szkiełka z mikrowzorem za pomocą PBS i inkubować kompletną pożywkę do hodowli komórek neuronalnych.
- Wysiewaj neurony hipokampa uzyskane od szczurów E18 Sprague-Dawley bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym z mikrowzorem o gęstości 50 000 komórek nacm2 w podłożu neurobazalnym (NBM) wzbogaconym o 3% surowicę końską. Umieść neurony z mikrowzorem w inkubatorze (37 °C, 5% CO2) przez 48 godzin
nuta: Po ~6 godzinach można zauważyć pierwotne neurony hipokampa przylegające do mikrowzorców lamininy.
- Wspólna hodowla ludzkich komórek macierzystych podobnych do GBM na neuronach
- Gdy komórki w kształcie sferoidy rosną w zawiesinie, odwirować zawiesinę przez 5 minut w temperaturze 200 × g. Przemyć sferoidy 5 ml PBS i inkubować komórki z 0,5 ml odczynnika do dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
- Dodać 4,5 ml kompletnego NBM (uzupełnionego suplementem B27, heparyną, czynnikiem wzrostu fibroblastów 2, penicyliną i streptomycyną, jak opisano wcześniej) i policzyć komórki przy użyciu techniki automatycznego liczenia.
- Wysiewaj 1,000 komórek GBM na mikrowzorzystej kulturze neuronalnej w NBM wzbogaconym o 3% surowicę końską. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.
