Izolacja i hodowla pierwotnych perycytów mózgu: procedura izolacji i hodowli perycytów z naczyń włosowatych mózgu bydła bez zanieczyszczenia komórek śródbłonka

Streszczenie

Źródło: Hørlyck, S. et al. Hodowla perycytów naczyń włosowatych mózgu do cytozolowych pomiarów wapnia i badań obrazowania wapnia.J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie pokazujemy procedurę izolacji i hodowli perycytów z naczyń włosowatych mózgu bydlęcego bez zanieczyszczenia komórkami śródbłonka.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Siew i hodowla naczyń włosowatych bydła

1. Dzień 0: Wymieszaj 0,7 ml kolagenu dożylnego z 6,3 ml PBS. Dodać roztwór do kolby T75 i pozostawić kolbę na 2 godziny w temperaturze pokojowej (RT) lub pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.
2. Wyjąć roztwór kolagenu z kolby i przemyć trzykrotnie PBS.
3. Dodać 7 ml roztworu roboczego fibronektyny i pozostawić kolbę na 30 minut w temperaturze pokojowej Następnie usuń roztwór fibronektyny i natychmiast po nim zasiej naczynia włosowate.
4. Podczas 30-minutowego czasu oczekiwania należy rozmrozić jedną fiolkę z naczyniami włosowatymi w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
5. Po rozmrożeniu kapilar natychmiast przenieść do probówki wirówkowej z 30 ml DMEM-comp i wirować przez 5 minut przy 500 x g i RT. Usunąć DMEM-comp z probówki i ponownie zawiesić kapilar w 10 ml świeżego DMEM-comp.
6. Przenieść zawiesinę o objętości 10 ml do powlekanej kolby T75 i pozostawić kapilary przylegające do dna kolby przez 4–6 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C przy 10% CO₂,
   nuta: Tempo wzrostu komórek jest wyższe przy 10% CO₂ niż konwencjonalne 5% CO_{2 .}
7. Po 4–6 godzinach inkubacji należy sprawdzić kolbę pod mikroskopem świetlnym. Frakcje naczyń włosowatych należy teraz przymocować do dna kolby (ryc. 1, dzień 0).
8. Przygotuj GM i bardzo ostrożnie odsysaj pożywkę DMEN-comp z naczyń włosowatych i zastąp ją 10 ml świeżo przygotowanego GM.
9. Dzień 2: Usuń GM z naczyń włosowatych i zastąp 10 ml świeżo przygotowanego GMO. W tym momencie wyrost komórkowy z naczyń włosowatych powinien być widoczny pod mikroskopem świetlnym (ryc. 1, dzień 2-3).

2. Izolacja pierwotnych perycytów z naczyń włosowatych mózgu bydlęcego

1. Dzień 4: Sprawdź naczynia włosowate pod mikroskopem świetlnym.
   nuta: Kolba powinna być teraz w około 60-70% zlewana, aby zapewnić odpowiednią ilość perycytów (ryc. 1, dzień 4). Jeśli tak nie jest; zastąpić GM 10 ml świeżej pożywki i pozostawić kolbę w inkubatorze na kolejny dzień.
2. Odessać pożywkę i delikatnie przemyć komórki w PBS.
3. Dodać 2 ml rozmrożonej trypsyny-EDTA dla komórek śródbłonka i pozostawić kolbę w inkubatorze na 1–3 minuty. W tym czasie często wyjmuj kolbę i obserwuj pod mikroskopem.
   nuta: Komórki śródbłonka powinny się zaokrąglić i odłączyć od kolby; Perycyty powinny być widoczne jako komórki o morfologii "ducha" i nadal być przyczepione do powierzchni kolby. Jest to trudny i ważny krok.Konieczne jest usunięcie większości komórek śródbłonka, aby uniknąć zanieczyszczenia monokultury perycytów, ale długotrwała trypsyna może również oderwać perycyty. Czas trypsynizacji może się nieznacznie różnić od czasu do czasu, dlatego niezwykle ważne jest, aby podczas zabiegu często obserwować kolbę pod mikroskopem.
4. Delikatnie postukaj w kolbę, gdy komórki śródbłonka zaczną się zaokrąglać, aby odłączyć rozluźnione komórki śródbłonka.
5. Aby zatrzymać trypsynizację, dodać 10 ml DMEM-comp do kolby. Ostrożnie przepłukać kolbę kilka razy pożywką w celu usunięcia komórek śródbłonka. Odessać zawiesinę komórek śródbłonka z kolby. Komórki śródbłonka mogą być teraz wykorzystywane do innych celów.
6. Dodać 10 ml DMEM-comp do kolby. Spójrz pod mikroskop świetlny, aby upewnić się, że perycyty są nadal obecne i przyczepione do dna. Umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze, aby umożliwić wzrost kultury wzbogaconej w perycyty.
   nuta: Ważne jest, aby obserwować kulturę w kolejnych dniach. Jeśli nadal rośnie duża liczba komórek śródbłonka, można przeprowadzić kolejną terapię trypsyną.
7. Pozwól monokulturze perycytów rosnąć ze zmianą pożywki DMEM-comp. co drugi dzień. Sprawdź wzrost komórek pod mikroskopem świetlnym (ryc. 1, dzień 5–8).

Wyniki

Rycina 1: Hodowla naczyń włosowatych i izolacja perycytów.Kapilary wyizolowano ze świeżego mózgu bydlęcego i wysiano w kolbach hodowlanych w dniu 0. Wyrost z naczyń włosowatych mózgu bydlęcego i następująca po nim izolacja perycytów były obserwowane przez kilka dni za pomocą mikroskopu świetlnego. Dzień 4a pokazuje wzrost komórek śródbłonka przed leczeniem trypsyną w celu usunięcia komórek śródbłonk...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pbs	Sigma Aldrich	Zobacz materiał D8537	Sól fizjologiczna buforowana fosforanami
Kolagen IV	Sigma Aldrich	Zobacz materiał C5533
Kolba T-75	Sigma Aldrich	CLS3972
Surowica płodowa bydlęca (FBS)	PAA/GE Opieka zdrowotna	A15-101
Fibronektyna	Sigma Aldrich	Zobacz materiał F1141
Trypsyna-EDTA	Sigma Aldrich	Zobacz materiał T4299
Mikroskop świetlny	Olympus	Olympus CK2	Pionowy mikroskop świetlny z kontrastem fazowym
Dmso	Sigma Aldrich	471267
heparyna	Sigma Aldrich	Zobacz materiał H3149
Inkubator komórkowy	Rybak termiczny
wirówka	Rybak termiczny	Wieloślad Heraeusa 3SR+	Standardowa wirówka o dużej objętości do wirowania komórek
Zmodyfikowane Orły Dulbecco Medium	Sigma Aldrich	D0819
Penicylina G Siarczan sodu/Streptomycyny	Sigma Aldrich	Zobacz materiał P0781
Aminokwasy endogenne MEM	Sigma Aldrich	Zobacz materiał M7145

powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział: