Izolacja naczyń włosowatych mózgu od ludzkiego mózgu: zoptymalizowana metoda ekstrakcji naczyń włosowatych mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej

Abstract

Źródło: Hartz, A. M. S. et al. Izolacja naczyń włosowatych mózgu od świeżej tkanki mózgowej człowieka. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film przedstawia izolację naczyń włosowatych mózgu z świeżej tkanki mózgowej człowieka. Wyizolowane naczynia włosowate można następnie wykorzystać do wygenerowania modelu bariery krew-mózg ex vivo.

Protocol

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Przygotowanie próbki mózgu

UWAGA: Rysunek 1A pokazuje schemat przepływu pracy całej procedury izolacji opisanej poniżej. Ludzka tkanka mózgowa może pochodzić z dowolnej części kory mózgowej i może być używana świeża lub mrożona. Zamrożoną tkankę mózgową można rozmrozić w temperaturze pokojowej (bez buforu; ~30 min na 10 g). Aby osiągnąć porównywalne wyniki, tkanka mózgowa powinna być pobrana z tego samego obszaru mózgu dla każdego eksperymentu. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem świeżej (interwał pośmiertny lub PMI <4 h) ludzkiej kory mózgowej, która nie została zamrożona.

1. Przygotowanie ludzkiej tkanki mózgowej: Udokumentuj wagę tkanki mózgowej. Wszystkie liczby w poniższym protokole są odpowiednie dla 10 g świeżej tkanki mózgowej człowieka. Umieść tkankę mózgową na szalce Petriego o średnicy 100 mm. Ostrożnie usuń wszystkie opony za pomocą kleszczy. Użyj skalpela, aby odciąć białą istotę.
2. Mielenie ludzkiej tkanki mózgowej: Ostrożnie pokrój tkankę mózgową i zmiel ją skalpelem. Mielemy przez około 5 minut (kawałki 2–3 mm). Przenieś tkankę mózgową do młynka do tkanek Potter-Elvehjem. Dodać 30 ml buforu izolacyjnego.
   nuta: Kawałki tkanki mielonej są trudne do zobaczenia, ponieważ tkanka mózgowa zamienia się w papkę w procesie mielenia.

2. Homogenizacja

1. Młynek do tkanek Potter-Elvehjem (prześwit: 150–230 μm): Homogenizuj każdą próbkę za pomocą 100 pociągnięć przy prędkości homogenizatora 50 obr./min. Udokumentuj czas co 25 uderzeń i całkowity czas potrzebny na 100 ruchów. Patrz Tabela 1 dla proponowanego protokołu homogenizacji; Całkowity czas homogenizacji 10 g ludzkiej kory czołowej wynosi około 22 minut. Nie mieszaj powietrza, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków.
2. Homogenizator Dounce (luz: 80–130 μm): Przenieść homogenat do homogenizatora Dounce na lodzie. Homogenizuj zawieszenie za pomocą 20 uderzeń (~6 s/suw, łącznie ~2 min). Unikaj bąbelków.

3. Wirowanie

1. Rozprowadź równomiernie homogenat mózgu w czterech probówkach wirówkowych o pojemności 50 ml i udokumentuj całkowitą objętość homogenatu. Rozprowadzić 50 ml buforu gradientu gęstości do probówek wirówkowych (12,5 ml na probówkę). Użyj 10 ml buforu izolacyjnego do przepłukania tłuczka i homogenizatora i rozprowadź do czterech probówek wirówkowych (~2,5 ml na probówkę).
2. Szczelnie zamknij probówki wirówkowe nakrętkami. Wymieszaj homogenat, pożywkę o gradiencie gęstości i buforuj, energicznie potrząsając probówkami. Wirować przy 5 800 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C (wirnik o stałym kącie nachylenia); Wybierz średnią prędkość zwalniania, aby pelety były przymocowane do rurki. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić każdą osadkę w 2 ml 1% BSA.

4. Filtracja

UWAGA: Aby oddzielić naczynia włosowate od czerwonych krwinek i innych szczątków komórek, konieczne jest kilka etapów filtracji.

1. Oczko 300 μm: Po ponownym zawieszeniu osadu przefiltruj zawiesinę przez siatkę 300 μm. Kapilary są filtrowane przez siatkę, podczas gdy większe naczynia i większe szczątki mózgu pozostają na siatce. Ostrożnie umyj siatkę z objętością do 50 ml 1% BSA. Odrzuć siatkę.
   nuta: Ten etap filtracji oczyszcza zawiesinę kapilarną z większych naczyń lub kawałków resztek mózgu.
2. Filtr odkształcający 30 μM
   nuta: Ten etap filtracji oddziela naczynia włosowate od czerwonych krwinek i innych zanieczyszczeń mózgu.
   1. Rozprowadzić filtrat kapilarny z kroku 4.1 na pięciu filtrach odkształceń komórkowych o wielkości 30 μm (około 10 ml filtratu kapilarnego na filtr odkształcenia komórkowego). Naczynia włosowate są zatrzymywane przez ten filtr, podczas gdy czerwone krwinki, inne pojedyncze komórki i małe szczątki mózgu przechodzą przez filtr i są zbierane w filtracie.
   2. Umyj każdy filtr 25 ml 1% BSA. Następnie wlej wszystkie filtraty na szósty filtr, aby zwiększyć wydajność. Umyj każdy filtr 50 ml 1% BSA; Utrzymuj filtry szczepu komórkowego z kapilarami i wyrzuć filtrat.

5. Kolekcja kapilarna

1. Odwróć filtry do góry nogami i umyj naczynia włosowate 50 ml 1% BSA dla każdego filtra do probówek o pojemności 50 ml. Delikatnie uciskaj końcówką pipety o pojemności 5 ml i przesuwaj ją po filtrze, aby zmyć naczynia włosowate mózgu.
2. Upewnij się, że zmyłeś wszystkie naczynia włosowate mózgu, zwłaszcza z krawędzi filtra. Unikaj pęcherzyków, ponieważ utrudnia to proces filtracji i zwiększa ryzyko utraty naczyń włosowatych.

6. Mycie

1. Po zebraniu kapilar odwirować wszystkie próbki o masie 1 500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C (wahliwy wirnik kubełkowy). Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w około 3 ml buforu izolacyjnego. Połącz wszystkie zawieszone granulki z jednej próbki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i napełnij ją buforem izolacyjnym. Ponownie odwirować przy 1.500 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i umyć jeszcze dwa razy.
2. Udokumentuj czystość naczyń włosowatych za pomocą mikroskopu (100-krotne powiększenie) i kamery (rysunek 1B).
   nuta: Wydajność naczyń włosowatych mózgu z 10 g ludzkiej tkanki mózgowej wynosi zwykle około 100 mg. Izolowane naczynia włosowate mózgu mogą być teraz wykorzystywane do eksperymentów, przetwarzane (np. lizat, izolacja błony) lub zamrażane błyskawicznie i przechowywane w temperaturze -80 °C w krioprobówkach przez co najmniej 6-12 miesięcy (unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).

Obrysy	Godzina
1–25	7–7,5
26–50	5–5,5
51–75	5–5,5
76–100	5–5,5
Czas całkowity:	Czas trwania: 22–24 min

Tabela 1: Protokół homogenizacji. Protokół homogenizacji dla młynka do tkanek Potter-Elvehjem do homogenizacji 10 g ludzkiej kory czołowej z prędkością homogenizacji 50 obr./min. Należy pamiętać, że kilka pierwszych pociągnięć wymaga dodatkowego czasu na homogenizację tkanki mielonej. Po tej wstępnej homogenizacji każde pociągnięcie trwa 12 s (6 s dla ruchu w dół, 6 s dla ruchu w górę). Tak więc, po wstępnej homogenizacji, można wykonać 5 uderzeń w ciągu 1 minuty lub 25 uderzeń w ciągu 5 minut.

Results

Rysunek 1: Schemat blokowy izolacji kapilarnej. (A) Piktogram ilustruje główne etapy procedury izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej tkanki ludzkiej. (B) Zdjęcie pokazuje izolowane naczynia włosowate ludzkiego mózgu pod mikroskopem świetlnym bezpośrednio po izolacji (100-krotne powiększenie).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Środki ochrony osobistej (PPE)
Rękawice lateksowe Diamond Grip Plus, Microflex Medium	VWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone	Nr kat. 32916-636	ŚOI
Jednorazowe ochronne fartuchy laboratoryjne	VWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 470146-214	Środki ochrony indywidualnej; ze względu na charakter materiału pozyskiwanego przez człowieka zaleca się stosowanie jednorazowego fartucha laboratoryjnego
Przyłbica ochronna, jednorazowa	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	19460102	Środki ochrony indywidualnej; ze względu na charakter materiału pozyskiwanego przez ludzi, zaleca się stosowanie jednorazowej osłony twarzy
Materiały bezpieczeństwa
Worki do autoklawu wysokotemperaturowego Clavies 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 01-815-6
Versi Suchy papier ławkowy 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 14-206-32	Do pokrycia obszarów roboczych
Systemy pojemnikowe VWR do ostrych narzędzi	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	Nr kat. 75800-272	Do używanych skalpeli
Wybielacz 8,2% Clorox Bakteriobójczy 64 uncje	Centrum Zaopatrzenia w Wielkiej Brytanii, Lexington, KY, USA	323775
Wyposażenie
4 °C Lodówka	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	13-986-148
pH-metr Accume BASIC AB15	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał AB15
Sterowanie Heidolph RZR 2102	Heidolph, Elk Grove Village, Illinois, Stany Zjednoczone	501-21024-01-3
Wirówka Sorvall LEGEND XTR	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	75004521
Mikroskop preparacyjny Leica L2	Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, Illinois, Stany Zjednoczone		Służy do usuwania opon mózgowych
Homogenizator POLYTRON PT2500	Kinematica AG, Lucerna, Szwajcaria	9158168
Waga P-403	Denver Instrument, Bohemia, Nowy Jork, Stany Zjednoczone	191392
Standardowe mini mieszanie	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	1151050
Termosy Ciekły Azot Dewar	Thermal Scientific, Mansfiled, Teksas, Stany Zjednoczone	11-670-4C	Służy do zamrażania tkanki
Waga analityczna Voyager Pro	OHAUS, Parsippany, NJ, Stany Zjednoczone	VP214CN
Mikroskop ZEISS Axiovert	Carl Zeiss, Inc Thornwood, Nowy Jork, Stany Zjednoczone		Służy do sprawdzania izolowanych naczyń włosowatych
Narzędzia i szkło
Pipeta Finnpipette II 1-5 ml	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	21377823T1	Zmyj kapilary z filtra
Pipeta Finnpipette II 100-1 000 μL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	21377821T1	Zawieś ponownie pellet w BSA
Chłopiec z pipetą	Integra, Hudson, NH, Stany Zjednoczone	739658
50 ml probówki Falcon 25/stojak - 500/os.	VWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone	21008-951
Ostrza skalpela EISCO	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	S95938C	Aby zmielić tkankę mózgową
PARAFILM	VWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone	52858-000	Do przykrycia zlewki i kolby miarowej
Thermo Scientific Końcówki do pipet Finntip 5 ml	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	21-377-304	Do zmywania naczyń włosowatych z filtra
Strzykawka 60 ml z Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, Stany Zjednoczone	BD309653	Używany z pierścieniem łączącym do filtrowania kapilar
Rękojeść skalpela #4	Fine Science Tools, Foster City, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy 10060-13	Służy do mielenia
Kleszcze Dumonta #5	Fine Science Tools, Foster City, Kalifornia, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy 11251-10	Służy do usuwania opon mózgowych
Młynek do tkanek Potter-Elvehjem	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, Stany Zjednoczone	3.43E+28	Objętość 50 ml, prześwit: 150-230 μm
Homogenizator z dounce	VWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone	Nr kat. 62400-642	Objętość 15 mL, prześwit: 80-130 μm
Filtry tkane Spectra/Mesh (300 μm)	Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, Kalifornia, Stany Zjednoczone	146424	Służy do filtrowania zawiesiny kapilarnej w celu usunięcia wszelkich opon mózgowych, które mogą pozostać
pluriSitka (wielkość porów: 30 μm)	pluriSelect Life Science, Lipsk, Niemcy	43-50030-03
Pierścień łączący	pluriSelect Life Science, Lipsk, Niemcy	41-50000-03	Wielokrotne używanie
Kolba miarowa 1 l			Do przygotowania buforu izolacyjnego
1 l zlewka			Do przygotowania 1% BSA
Mieszaj baton			Do przygotowania 1% BSA i Ficollu®
Butelka Schott (60 ml)			Do przygotowania Ficollu®
Wiadro na lód			Aby wszystko było zimne
Szalka Petriego 100 mm			Do mielenia tkanki mózgowej
Skrobak do komórek kultury tkankowej	VWR, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone	89260-222	Do usuwania supernatantu po odwirowaniu
Chemikalia
BSA frakcja V, A-9647	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	A9647-500g	Przygotuj w DPBS z Ca2+ i Mg2+ dzień wcześniej. Unikaj bąbelków podczas przygotowywania. Przechowywać w lodówce. Powoli mieszaj przez 10 minut przed użyciem.
DPBS z Ca2+ i Mg2+	Klon	SH30264.FS	DPBS - część bufora izolacyjnego
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał F4375	Ważny jest tutaj dokładny pomiar. Odważyć w butelce z mieszadłem. Wstrząśnij wigojnie po dodaniu DPBS. Przechowywać w lodówce O/N. Rano będzie pogodnie. Mieszaj delikatnie przez 10-15 minut przed użyciem. Trzymaj na lodzie do czasu użycia.
Glukoza (D-(+) dekstroza)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał G7528	Stężenie glukozy (D-(+)dekstrozy): 5 mM
Roztwór wzorcowy wodorotlenku sodu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 71474	Aby dostosować pH DPBS
Pirogronian sodu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone	Zobacz materiał P2256	Stężenie: 1 mM