Fluorescencyjna zymografia peptydów: zmodyfikowana technika wykrywania aktywności proteazy za pomocą substratów fluorogennych w żelach zymogramowych

Streszczenie

Źródło: Deshmukh, A. A. et al. Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej. J. Vis. Exp. (2019 rok)

W tym filmie wykonujemy zymografię, technikę elektroforetyczną, aby przeanalizować aktywność proteolityczną w próbkach biologicznych.

Protokół

1. Elektroforeza próbek biologicznych w żelach peptydowych

1. Próbki rozpuścić w konwencjonalnym buforze do próbek zymografii (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% glicerol, 4% SDS, 0,01% błękit bromofenolowy). W przypadku próbek komórek i tkanek zaleca się ~30 μg całkowitego białka na studzienkę i 50–100 ng białka w przypadku wzorców MMP.
2. Dodaj 400 ml 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer do aparatu żelowego. Załadować do 35 μl próbki na studzienkę. Badać próbki pod napięciem 120 V w temperaturze 4 °C przez 1,5 godziny lub do momentu, gdy wzorce masy cząsteczkowej wykażą, że interesujące proteazy znajdują się w warstwie żelu rozdzielającego peptydy (która ma widoczny pomarańczowy kolor).
   nuta: Większość MMP i ich wariantów mieści się w zakresie 35–100 kDa. Gdy wzorce masy cząsteczkowej wskazują, że masy te znajdują się w warstwie żelu rozdzielczego peptydów, elektroforezę można zatrzymać. Tę samą zasadę można zastosować do innych klas proteaz o znanych masach cząsteczkowych. Jeśli istnieje zainteresowanie wykrywaniem wielu proteaz w większym zakresie mas cząsteczkowych, należy zmniejszyć rozmiar warstwy żelu rozdzielczego i zwiększyć rozmiar warstwy żelu rozdzielczego peptydów.
3. Po elektroforezie wyjąć żele z plastikowej kasety i myć żele trzy razy przez 10 minut każdy w temperaturze pokojowej pod delikatnym mieszaniem w buforze renaturyzacyjnym zawierającym 2,5% Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ i 5 mM CaCl₂ w 50 mM Tris-HCl, pH 7,5.
4. Przenieść żele do rozwijającego się roztworu buforowego zawierającego 1% Triton X-100, 1 μM ZnCl₂ i 5 mM CaCl₂ w 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 przez 15 min. Zastąpić świeżym roztworem buforowym do wywoływania i inkubować żele w temperaturze 37 °C pod delikatnym mieszaniem przez 24 godziny, upewniając się, że żele są całkowicie zanurzone w roztworze.
5. Po 24 godzinach zobrazuj żele za pomocą skanera/imagera z żelem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Puste kasety żelowe 1,5 mm	ThermoFisher Naukowy	NC2015
20% rozwiązanie SDS	Ambion	Zobacz materiał AM9820
3x bufor próbki Zymography	Bio-Rad	1610764
Zestaw Azido-PEG3-Maleimid	Kliknij Narzędzia chemiczne	AZ107
Podstawowy zasilacz PowerPac	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dwukolorowy Standard	Bio-Rad	Numer katalogowy: 161-0374
Igły podskórne PrecisionGlide	Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 14-826