Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Skoncentrowany system ultrasonograficzny
UWAGA: Opisana konfiguracja to zbudowany przez nas system zakłócający BBB oparty na dostępnych na rynku komponentach i zawiera wydrukowany w 3D stożek na zamówienie oraz odłączaną platformę stereotaktyczną. System został zaprojektowany modułowo, co ułatwia modyfikacje w zależności od dostępnego wyposażenia i konkretnego zastosowania. Protokół opisuje procedurę sonoporacji większego obszaru w okolicy mostu mózgu myszy. Dostosowując lokalizację docelową, można celować w różne części mózgu. W pracy wykorzystano przetwornik monoelementowy 1 MHz o ogniskowej 75 mm, aperturze 60 mm i polu ogniskowym 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM ciśnienia szczytowego). Płaszczyzna ogniskowa przetwornika jest umieszczona przez czaszkę zwierzęcia w płaszczyźnie poziomej przecinającej się z listwami usznymi.
- Wybierz odpowiedni przetwornik do otwarcia BBB u gryzoni.
nuta: W zależności od właściwości mikropęcherzyków i zastosowanej częstotliwości, ustawienia akustyczne, w szczególności indeks mechaniczny (MI), mogą ulec zmianie.
- Umieść przetwornik w stożku wydrukowanym w 3D.
- Zastosuj akustycznie przezroczystą membranę mylarową na dolnym końcu stożka, aby uzyskać akustyczne sprzężenie ścieżki rozchodzenia się wiązki i napełnij stożek odgazowaną wodą.
- Zamontuj przetwornik nad zwierzęciem na zmotoryzowanym stoliku liniowym, jak pokazano na rysunku 1, umożliwiając automatyczne ustawienie przetwornika w pionie.
- Zaprojektuj odłączaną platformę stereotaktyczną w oparciu o wymagania badania, która obejmuje ogrzewanie o regulowanej temperaturze, pręty zgryzowe i douszne, znieczulenie i multimodalne markery referencyjne, jak pokazano na rysunku 1 i rysunku 2. Mocowanie platformy stereotaktycznej składa się z liniowego systemu stolików 2D, który umożliwia precyzyjne automatyczne pozycjonowanie (< 0,1 mm) zwierzęcia pod belką.
- Podłączyć przetwornik do łańcucha emisji akustycznej pokazanego na rysunku 1 , składającego się z przetwornika, generatora funkcyjnego i wzmacniacza mocy.
- Opracowanie potoku przetwarzania obrazu w celu wykrycia multimodalnych markerów fiducialnych, które umożliwiają precyzyjne ukierunkowanie sonoporacji na obszar zainteresowania mózgu i zbieranie danych kawitacji wykrytych przez hydrofon igłowy.
- Skalibruj system i określ punkt ostrości przetwornika zgodnie z pionowym ustawieniem zwierzęcia na platformie stereotaktycznej.
2. Przygotowanie zwierząt
UWAGA: Następujący protokół jest określony dla myszy, ale może być dostosowany do szczurów. Do tych eksperymentów wykorzystano samice atymicznych nagich myszy Foxn1-/- (w wieku 6-8 tygodni).
- Pozwól zwierzęciu zaaklimatyzować się przez co najmniej tydzień w obiekcie dla zwierząt i regularnie waż zwierzę.
- Buprenorfinę (0,05 mg/kg) należy podać we wstrzyknięciu podskórnym (podskórnie) 30 minut przed leczeniem FUS w celu rozpoczęcia leczenia przeciwbólowego.
- Znieczulić zwierzę 3% izofluranem, 2 l/minO2 i sprawdzić, czy zwierzę jest głęboko znieczulone. Utrzymuj zwierzęta w znieczuleniu podczas całego zabiegu i monitoruj częstotliwość oddechów i tętno, aby dostosować stężenie izofluranu zgodnie z wymaganiami.
- Nałóż maść do oczu, aby zapobiec suchości oczu i uniknąć możliwych obrażeń.
- Usuń włosy na czubku głowy za pomocą maszynki do golenia i kremu do depilacji, a następnie umyj je wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości i uniknąć podrażnienia skóry.
- W przypadku eksperymentów z modelami guzów BLI wstrzyknij 150 μl D-lucyferyny (30 mg / ml) dootrzewnowo (i.p.) za pomocą strzykawki insulinowej 29G w celu uzyskania wskazówek obrazowych BLI.
- Wprowadzić cewnik do żyły ogonowej o stężeniu 26–30 G i przepłukać cewnik i żyłę niewielką objętością roztworu heparyny (5 UI/ml). Napełnij cewnik roztworem heparyny, aby uniknąć krzepnięcia krwi.
nuta: Dobre cewnikowanie jest widoczne, gdy dochodzi do refluksu krwi do cewnika. Unikaj pęcherzyków powietrza w cewniku, aby zapobiec zatorowi. Aby uniknąć nadmiernego ciśnienia we wstrzyknięciu, należy upewnić się, że długość cewnika jest jak najkrótsza.
- Umieść zwierzę na platformie stereotaktycznej o regulowanej temperaturze, aby uniknąć hipotermii.
nuta: Hipotermia zmniejsza krążenie krwi, co może wpływać na wstrzykiwanie/krążenie mikropęcherzyków i farmakokinetykę leków.
- Unieruchom i zamocuj głowę zwierzęcia na platformie stereotaktycznej za pomocą nauszników i drążka do gryzienia. Przymocuj ciało paskiem i przyklej ogon zwierzęcia do platformy.
3. Skoncentrowane ultradźwięki in vivo sterowane obrazem
UWAGA: Dla tego protokołu użyto monoelementowego przetwornika 1 MHz z impulsem tonalnym o czasie trwania 10 ms, MI 0,4 i częstotliwością powtarzania impulsów 1,6 Hz z 40 cyklami przez 240 s. Protokół jest zoptymalizowany dla mikropęcherzyków stabilizowanych fosfolipidami zawierającymi sześciofluorek siarki (SF6) jako nieszkodliwy gaz, przy czym średnia średnica pęcherzyków wynosi 2,5 μm, a ponad 90% pęcherzyków jest mniejszych niż 8 μm.
- Umieść platformę stereotaktyczną z zamontowanym zwierzęciem w trybie obrazowania (np. BLI lub rentgenowskim) i wykonaj zdjęcie (zdjęcia) zwierzęcia.
- Użyj multimodalnych znaczników odniesienia w połączeniu z potokiem przetwarzania obrazu, aby oznaczyć pozycję zwierzęcia zgodnie z punktem skupienia przetwornika.
- Określ obszar docelowy, umieszczając kontur mózgu na uzyskanym obrazie rentgenowskim lub używając obrazów BLI do określenia środka guza (ryc. 2). Położenie poszczególnych części mózgu jest określone w Atlasie Mózgu Paxinos, wykorzystując oznaczenia czaszki bregma i lambda jako punkty odniesienia. Na przykład pon znajduje się x=-1,0, y=-0,8 i z=-4,5 od lambda.
- Osłoń nozdrza i pysk zwierzęcia taśmą samoprzylepną, aby żel ultradźwiękowy nie zakłócał oddychania.
- Nałóż żel ultradźwiękowy na czubek głowy zwierzęcia.
- Zwiń skórę szyi zwierzęcia, nasmaruj hydrofon igłowy żelem ultradźwiękowym i umieść hydrofon igłowy w bezpośrednim sąsiedztwie kości potylicznej.
- Ustaw przetwornik we właściwej pozycji, korzystając z potoku przetwarzania obrazu i punktu ostrości.
- Zastosuj wstępnie skonfigurowane ustawienia do wszystkich podłączonych urządzeń i skieruj się na obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania.
nuta: W zależności od pytania badawczego, obszary guza lub mózgu mogą być sonoporowane jako pojedynczy punkt ogniskowy lub jako kształt wolumetryczny, jak pokazano na rycinie 2.
- Aktywuj mikropęcherzyki zgodnie z opisem producenta. Wstrzyknąć jeden bolus zawierający 120 μl (5,4 μg) mikropęcherzyków.
- Przepłucz cewnik do żyły ogonowej solą fizjologiczną, aby sprawdzić otwarcie cewnika.
- Wstrzyknij mikropęcherzyki i rozpocznij insonację.
- Nagraj kawitację mikropęcherzyków za pomocą hydrofonu igłowego.
- Podać donaczyniowy środek kontrastowy lub lek po sonoporacji. Dawka, czas i planowanie zależą od celu badania i leku.
nuta: Niebieski Evans jest powszechnym środkiem barwiącym do oceny otwarcia BBB.
- Monitorować zwierzę do ustalonego z góry punktu czasowego lub przed osiągnięciem humanitarnego punktu końcowego.
