Dostarczanie genów oparte na elektroporacji in utero: technika wstrzykiwania plazmidowego DNA do embrionalnych komórek móżdżku mysich zarodków

Streszczenie

Źródło: Feng W. et al. Analiza utraty funkcji za pośrednictwem CRISPR w komórkach ziarnistych móżdżku przy użyciu transferu genów opartego na elektroporacji in utero. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje dostarczanie plazmidowego DNA do komórek neuronalnych móżdżku mysich zarodków za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta jest przydatna do zrozumienia funkcji genów in vivo w prawidłowym rozwoju mózgu oraz zmian w ekspresji genów komórek neuronalnych podczas progresji guza.

Protokół

1. Wykonaj elektroporację in utero

1. Wyhoduj myszy w wieku od 6 do 8 tygodni i przygotuj narzędzia do elektroporacji in utero. Skrzyżowanie samców homozygotycznych myszy Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP z samicami myszy CD-1. Czas ciąży myszy CD-1 od dnia wykrycia czopa dopochwowego (E0,5). Zarodki są elektropostowane w dniu E13.5.
   1. Wyciągnij kapilary ze szkła borokrzemianowego (średnica wewnętrzna: 0,6–0,8 mm) za pomocą ściągacza do mikropipet. Użyj następujących ustawień: P = 500, Ciepło = 560, Ciąg = 150, Vel = 75, Czas = 250. Oznacz końcówkę kapilarną czarnym tuszem, aby uzyskać lepszą wizualizację podczas wstrzykiwania. Przytnij stożek kapilarny pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą linijki i ostrej pęsety igłowej i przytnij końcówkę na długość około 6 mm.
   2. Utrzymuj jedność naczyń włosowatych, aby eksperyment był powtarzalny. Utwórz jednostronnie ściętą krawędź podczas przycinania. Końcówka powinna być jak najbardziej ostra, aby ułatwić penetrację ściany macicy i uniknąć uszkodzenia tkanek zarodka.
      nuta: Alternatywnie użyj mikromłynka, aby wyregulować kąt 35°. Kapilary można przechowywać w temperaturze pokojowej na 10-centymetrowej szalce Petriego w warunkach wolnych od patogenów.
   3. Autoklaw narzędzi chirurgicznych.
   4. Wymieszać plazmidy sgRNA w równych częściach z pT2K-IRES-Luc do końcowego stężenia co najmniej 1 μg/μL dla każdego plazmidu i zabarwić roztwór plazmidu szybką zielenią (końcowe stężenie 0,05%). Przygotuj 1% szybki zielony roztwór podstawowy z wodą destylowaną wolną od endotoksyn i przefiltruj przez filtr 0,22 μm, aby usunąć cząsteczki barwnika z roztworu.
      nuta: Kotransfekcja pT2K IRES-Luc jest opcjonalna, ale pozwala na identyfikację zdolnych do życia zwierząt po urodzeniu za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Przygotować wystarczającą ilość mieszanki plazmidów dla całkowitej liczby ciężarnych myszy, które mają być operowane. Użyj około 15-20 μl mieszanki na mysz (~12 zarodków). Natychmiast przystąp do zabiegu.
2. Przygotuj myszy do operacji
   1. Znieczulenie ciężarnych myszy CD-1 izofluranem. Znieczulenie należy indukować w pudełku za pomocą izofluranu o stężeniu 3–4% obj. (natężenie przepływu tlenu: 1,5 l/min) i utrzymywać je na poziomie 2% obj. podczas operacji przez stożek nosowy.
      nuta: Cały zabieg nie powinien trwać dłużej niż 30 minut. W razie potrzeby należy zmniejszyć liczbę wstrzykiwanych i elektroporowanych zarodków. Do zabiegu należy używać sterylnych rękawiczek.
   2. Połóż mysz na plecach na poduszce grzewczej i dostosuj znieczulenie.
   3. Wstrzyknąć środek przeciwbólowy (Metamizol, 800 mg/kg masy ciała, podskórnie (s.c.), 24 h depot).
      nuta: Można stosować inne dopuszczone leki przeciwbólowe niż Metamizol.
   4. Zastosuj maść do oczu, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu.
   5. Przymocuj kończyny taśmą i wysterylizuj brzuch środkiem dezynfekującym. Przykryj mysz gazą, pozostawiając odsłonięte tylko obszar chirurgiczny. Rozprowadź 70% etanolu na obszarze operacyjnym i gazie.
   6. Wykonaj nacięcie skóry o długości około 2 cm i delikatnie poszerz szczelinę prostymi nożyczkami chirurgicznymi. Zlokalizuj linea alba i wykonaj nieco mniejsze drugie nacięcie przez otrzewną za pomocą nożyczek do tkanek z końcówką.
   7. Zwilż otwartą jamę brzuszną wstępnie podgrzanym sterylnym 1x PBS.
   8. Ostrożnie wyjmij rogi macicy z jamy brzusznej za pomocą kleszczy pierścieniowych. Pociągnij delikatnie, chwytając ścianę macicy wyłącznie w szczelinie między woreczkami żółtkowymi dwóch sąsiednich zarodków. Unikaj wywierania nacisku na zarodek podczas przeciągania go przez nacięcie. W razie potrzeby powiększ nacięcie i zachowaj szczególną ostrożność, aby ułożyć rogi macicy na brzuchu, nie uciskając przepływu krwi przez tętnicę macicy.
      nuta: W niektórych przypadkach zaleca się ekstrakcję jednego rogu macicy na raz i zastąpienie go przed przystąpieniem do drugiego rogu macicy.
3. Iniekcja i elektroporacja plazmidowego DNA
   1. Odessać około 15 μl kolorowego roztworu plazmidu za pomocą przygotowanej szklanej kapilary. Podczas tego procesu należy unikać pęcherzyków powietrza.
      nuta: Roztwór plazmidu może łatwo zatkać końcówkę, jeśli jego stężenie jest wysokie. Przetestuj naczynia włosowate, uwalniając część DNA tuż przed wstrzyknięciem.
   2. Delikatnie przytrzymaj zarodek kleszczami pierścieniowymi i zlokalizuj obszar szyi.
      nuta: Jeśli zarodek znajduje się w pozycji trudnej do wstrzyknięcia, pomiń go i przejdź do następnego zarodka. Zwiększona repozycja zarodka może zwiększyć ryzyko ich uszkodzenia.
   3. Powoli przebić końcówką wcześniej przygotowanej szklanej kapilary do czwartej komory, przenikając przez grzbiet tyłomózgowia, a następnie wstrzyknąć około 1 μl mieszanki plazmidów. Upewnij się, że barwione DNA nie wycieka z mózgu i jest widoczne jako struktura w kształcie rombu.
      nuta: Opcjonalnie użyj 2,5-krotnych szkieł powiększających, aby uzyskać lepszą wizualizację czwartej komory i otaczających ją naczyń krwionośnych. Dostarczyć impulsy elektryczne natychmiast po wstrzyknięciu, aby zapobiec dyfuzji roztworu plazmidu do innych komór.
   4. Zastosuj elektryczne impulsy kwadratowe (5 impulsów, 32 mV, 50 ms-włączone, 950 ms-wyłączone) za pomocą platynowej pęsety przypominającej kleszcze (patrz Tabela materiałów). Umieść elektrody bocznie, tak aby biegun ujemny zakrywał ucho, a biegun dodatni znajdował się w zawiązkach móżdżku nad ścianą macicy. Użyj płytek elektrod o średnicy 5 mm do skutecznej elektroporacji zarodków E13.5.
      nuta: Zwiększ przeżywalność młodych, manipulując mniej niż 2/3 całkowitej liczby zarodków na matkę. Unikaj zarodków zbyt blisko szyjki macicy. Jeśli zostaną zmanipulowane, mogą spowodować komplikacje podczas porodu i zagrozić całemu miotowi. Jeśli elektrody znajdują się zbyt blisko serca zarodka, może to spowodować zatrzymanie akcji serca.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Taśma do autoklawu	Kisker Biotechnologia	150262
Elektro kwadratowy porator	Karta BTX (BTX)	Sterownik ECM830
Zestaw Endofree Maxi	Qiagen powiedział:	Numer katalogowy: 12362
etanol	Merck	107017
Maść do oczu (Bepanthen)	Bayer	81552983
Szybki zielony	Merck	104022
Filtr (0,22 μm)	Merck	F8148
Kleszcze proste	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 91150-20
Gaza (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Naukowy	15387311
Szklana kapilara z żarnikiem	Narishige powiedział:	GD1-2
Poduszka grzewcza	Lakier ThermoLux	463265 / -67
Izofluran	Urządzenie Zoetis	TU061219
Kleszcze pierścieniowe	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11103-09
Mikroskop stereoskopowy	Nikon	C-PS
Nożyczki chirurgiczne	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 91460-11
Nożyczki chirurgiczne z końcówką	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14072-10
Pęseta z elektrodami dyskowymi 5mm, Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Metamizol	Wdt
Niesterylna nić jedwabna do szwów (0,12 mm)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 18020-50
PBS (1x)	Technologie życiowe	14190169
Nożyczki do tkanek Blunt (11,5 cm)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14072-10
pCAG-EGxxFP	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 50716
Plazmid pX330	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 42230

powiedział: powiedział: