Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie myszy i chirurgia
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano 8-tygodniowe, męskie i żeńskie myszy C57BL/6J. Warunki operacji są zgodne z zasadami IACUC naszej placówki. Narzędzia są sterylizowane, chirurgiczna powierzchnia robocza jest dezynfekowana, zwierzę jest dezynfekowane, a chirurg nosi sterylne rękawice.
- W dniu poprzedzającym zabieg znieczulij mysz za pomocą 2% izofluranu, a następnie usuń sierść wzdłuż kości udowej po stronie grzbietowej za pomocą cienkiej maszynki do golenia lub chemicznego środka do usuwania włosów.
- W dniu zabiegu znieczulić myszy za pomocą 2% izofluoranu w komorze indukcyjnej. Potwierdź znieczulenie bodźcem szczypania palca u nogi i brakiem odpowiedzi.
- Nałóż maść weterynaryjną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu w znieczuleniu.
- Umieść znieczuloną mysz na jej brzusznej stronie i delikatnie zabezpiecz każdą kończynę hipoalergiczną taśmą, aby wytworzyć łagodne napięcie w kończynie, która ma zostać wstrzyknięta. Znieczulenie jest utrzymywane za pomocą izofluranu podawanego za pomocą precyzyjnego waporyzatora i stożka nosowego.
- Oczyścić miejsce wstrzyknięcia preparatem Betadine, a następnie ponownie roztworem alkoholu o stężeniu 70%. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy. Upewnij się, że na polu operacyjnym nie pozostały żadne luźne włosy.
- Wykonaj 1 cm nacięcie małymi nożyczkami około 2 mm poniżej i równolegle do kości udowej. Cofnij skórę kleszczami na boki, aby odsłonić mięśnie pod spodem.
- Nerw kulszowy biegnie głęboko do mięśni pośladkowych wielkich i dwugłowych uda. Oddziel te dwa mięśnie wzdłuż płaszczyzny powięziowej małymi nożyczkami i odsłoń nerw kulszowy pod spodem. Uwolnij nerw z otaczających mięśni za pomocą rozwarstwienia.
- Pobrać 3 μl komórek rakowych (około 50 000 komórek) z osadu do strzykawki o pojemności 10 μl.
nuta: Alternatywnie należy pobrać 3 μl PBS jako kontrolę.
- Umieść małą metalową szpatułkę pod nerwem w miejscu wstrzyknięcia, aby uzyskać wsparcie. Pod wizualizacją za pomocą mikroskopu preparacyjnego włóż igłę do nerwu przy metalowej podstawie, utrzymując igłę jak najbardziej równolegle do nerwu po wkłuciu. Uważaj, aby nie przebić tylnej części nerwu. Zminimalizuj obchodzenie się z nerwem tak bardzo, jak to możliwe podczas całego tego procesu.
- Powoli wstrzykiwać do nerwu przez 5 sekund. Utworzenie się bańki w obszarze wstrzyknięcia wskazuje na dobry wtrysk. Następnie pozostaw igłę na miejscu na 3 sekundy przed delikatnym wyjęciem igły. Trzymanie igły na miejscu przez 3 sekundy minimalizuje cofanie się komórek z nerwu.
nuta: Wstrzyknięcie można wykonać w kierunku dystalnego nerwu lub rdzenia kręgowego. Ważne jest, aby zachować spójność w ramach zestawu eksperymentów. Jeśli komórki wyleją się na zewnątrz, zwierzę nie powinno być uwzględniane w analizie doświadczenia. Z doświadczenia wynika, że takie zdarzenia zdarzają się bardzo rzadko.
- Przywróć nerw do jego pierwotnej pozycji. Zakryj nerw leżącymi nad nim mięśniami. Potraktuj myszy odpowiednią analgezją, a następnie zamknij skórę szwami nylonowymi 5-0.
- Umieść mysz samą w czystej klatce do obserwacji podczas rekonwalescencji, aż całkowicie obudzi się ze znieczulenia.
nuta: Odzyskanie pełnej przytomności przez zwierzę zajmuje 5–15 minut. Zwierzę nie jest pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Zwierzę nie wraca do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie zostanie w pełni wyleczone. Następnie należy oceniać regenerację co najmniej raz na 24 godziny przez 72 godziny.
