$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie myszy do wstrzyknięcia komórek nowotworowych
- Znieczulić mysz przez dootrzewnowe (i.p.) wstrzyknięcie koktajlu ketamina/ksylazyna (ketamina 100 mg/kg, ksylazyna 10 mg/kg).
- Potwierdź pełne znieczulenie, szczypiąc stopy zwierzęcia i obserwuj brak odpowiedzi.
- Umieść mysz na szklanej płytce (używanej do odlewania żeli białkowych) i zabezpiecz gumkami.
- W razie potrzeby usuń włosy z szyi, goląc się lub nakładając niewielką ilość produktu do depilacji i wycierając włosy ręcznikiem papierowym.
nuta: Jeśli używasz nagich myszy, pomiń ten krok, ponieważ nie mają one włosów na ciele.
- Oczyść skórę szyi, stosując powidon-jod i 70% alkoholu.
- Umieść mysz na stoliku mikroskopu preparacyjnego
- Wykonać nacięcie w skórze o długości ~1 cm za pomocą skalpela chirurgicznego.
- Tępo wypreparuj mięsień za pomocą ząbkowanych kleszczy, aby odsłonić tętnicę szyjną pod spodem.
- Oddziel tętnicę szyjną od sąsiedniego nerwu błędnego za pomocą kleszczy chirurgicznych.
- Za pomocą kleszczy chirurgicznych oddziel trochę bawełny od wacika, zwilż i ułóż w mniejszy wacik. Umieścić ten nawilżony buforem wacik pod tętnicą szyjną w zamierzonym miejscu wstrzyknięcia.
- Umieść szew dystalnie i proksymalnie do wacika i zrób luźne węzły. Zacisnąć węzeł proksymalny, aby zablokować przepływ krwi do miejsca wstrzyknięcia.
- Kontynuuj wstrzyknięcie komórki rakowej, jeśli tętnica szyjna na waciku wydaje się być pod pełnym ciśnieniem ze świeżą czerwoną krwią.
2. Wstrzyknięcie komórek rakowych do tętnicy szyjnej
- Wykonać wir i pobrać 100 μl komórek rakowych do strzykawki.
- Pod mikroskopem preparacyjnym powoli włóż igłę 31G (skosem do góry) do światła tętnicy szyjnej znajdującej się na wierzchu wacika.
- Powoli wstrzyknąć komórki ze strzykawki do tętnicy szyjnej. Udane wstrzyknięcie można zaobserwować pod mikroskopem po zmianie koloru pobliskich naczyń krwionośnych i mięśni, gdy buforowane komórki rakowe są wpychane do krążenia.
- Po zakończeniu wstrzykiwania całej objętości należy delikatnie unieść dystalną tętnicę szyjną, aby zapobiec niedomykalności.
- Szybko zaciśnij węzeł dystalny, aby zakończyć proces wstrzykiwania.
- Po zakończeniu iniekcji należy zacisnąć ligatury i przyciąć nadmiar jedwabnego szwu za pomocą mikronożyczek pod mikroskopem preparacyjnym. Cofnij oddzielony mięsień, aby zakryć miejsce rany. Zamknij skórę dwoma zszywkami.
3. Rekonwalescencja chirurgiczna
- Przenieś operowane zwierzę na poduszkę grzewczą w celu odzyskania zdrowia. Odzyskanie przytomności przez zwierzęta może zająć 30–60 minut. W międzyczasie należy podawać buprenorfinę (0,05 mg/kg) we wstrzyknięciu podskórnym jako znieruchoność pooperacyjną.
nuta: Analgezja powinna być zapewniona zgodnie z lokalnym protokołem zatwierdzonym przez IACUC.
- Gdy zwierzęta się obudzą i powrócą do swojego normalnego zachowania, przywróć myszy do ich miejsca zamieszkania. Zapewnij myszom żelowy pokarm przez kilka dni po operacji. Prowadź dokumentację chirurgiczną i przechowuj ją w pokoju.
4. Nieinwazyjne obrazowanie in vivo
- W przypadku komórek znakowanych konstruktami reporterowymi lucyferazy zmierz skuteczność wstrzykiwania komórek rakowych za pomocą systemu obrazowania in vivo.
nuta: Obrazowania nie wykonuje się w dniu wstrzyknięcia, aby uniknąć nadmiernego stresu u zwierząt badawczych.