Długoterminowe ortotopowe przeszczepianie komórek nowotworowych do zarodków danio pręgowanego: skuteczna metoda dostarczania komórek nowotworowych do czwartej komory zarodków danio pręgowanego w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych

Streszczenie

Źródło: Casey, M. J. et al. Przeszczepianie guzów mózgu u dzieci danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki.J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje ortotopową transplantację komórek guza mózgu danio pręgowanego do czwartej komory zarodka gengenożera immunokompetentnego. Procedura ta pozwala na długoterminowe badanie inwazji i zachowania komórek nowotworowych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Wstrzykiwanie zawiesiny guza do czwartej komory zarodka o zawartości 2 dpf

1. Przenieść 10–20 znieczulonych zarodków z dekorionacją na obrzeża płytki iniekcyjnej za pomocą pipety transferowej; zarodki powinny opadać bocznie na płytkę iniekcyjną, z wyraźnie widocznymi i dostępnymi komorami. W razie potrzeby należy użyć sondy kątowej, aby wyregulować zarodki i umieścić je z dala od zewnętrznej krawędzi płytki iniekcyjnej.
2. Załadować 1–2 μl zawiesiny komórek nowotworowych do igły iniekcyjnej za pomocą końcówek pipet z żelem i wprowadzić igłę do manipulatora.
3. Ręcznie opuść manipulator, trzymając igłę pod kątem 45°. Wyreguluj pokrętła na mikromanipulatorze w kierunkach x, y i z, aż igła znajdzie się tuż nad i około 5 mm po prawej stronie głowy zarodka. Spójrz przez okulary mikroskopu stereoskopowego i powoli ustaw mikromanipulator w kierunku x, aż igła przebije czwartą komorę zarodka. Nie pozwól, aby igła przebiła serce lub żółtko.
   1. Naciśnij pedał nożny przymocowany do mikrowstrzykiwacza, aby wstrzyknąć zawiesinę komórek nowotworowych.
      nuta: Ciśnienie i czas wtrysku będą się różnić w zależności od rozmiaru otworu igły, ale dobrym punktem wyjścia jest 5–10 PSI i 50–100 ms. Objętość wstrzykniętych komórek nowotworowych można ocenić za pomocą standardowych technik kropli oleju poprzez wstrzyknięcie do oleju mineralnego, jeśli jest to pożądane. Najlepsze rezultaty dają zazwyczaj wstrzyknięcia po 500 ml o średnicy kropli 0,1 mm.
4. Delikatnie spłucz wstrzyknięte zarodki z płytki iniekcyjnej na szalkę Petriego, używając świeżej wody z jaj (0,6 g/l soli akwariowej w wodzie z odwróconej osmozy + 0,01 mg/l błękitu metylenowego). Utrzymuj zarodki w wodzie jajowej do pozostałych zabiegów lub do czasu, gdy będą hodowane w zbiornikach.
5. Zbadaj wstrzyknięte zarodki pod stereoskopem fluorescencyjnym. Upewnij się, że ciśnienie iniekcji, kąt, rozmiar igły i lepkość zawiesiny komórek powodują, że komórki nowotworowe wypełniają 25–50% przestrzeni komory. W razie potrzeby dostosuj te parametry.
6. Powtórz kroki 1.1–1.5 dla pozostałych zarodków. W razie potrzeby znieczulić dodatkowe zarodki.
   nuta: Doświadczony użytkownik może wstrzyknąć do 300 zarodków w ciągu 3-4 godzin.
7. Umieść zarodki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 28°C na noc.
8. Następnego dnia oceń przeżywalność zarodka, badając cechy morfologiczne i fizjologiczne, takie jak prawidłowy rozwój serca i mózgu, zgodnie z opisem.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Woda jajeczna	Na miejscu		Utrzymanie zarodków, wykonanie płytki iniekcyjnej
szalka Petriego	Rybak termiczny	FB0875711Z	Przechowywanie zarodków, wytwarzanie płytki iniekcyjnej
Szklany pojemnik	Dowolna marka handlowa		Wykonanie płyty wtryskowej
Mikropipety	Dowolna marka handlowa		Zawieszenie i przeszczep guza
Sonda kątowa	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 10140-02	Manipulacja zarodkami
Pipeta transferowa	Dowolna marka handlowa		Manipulacja zarodkami
Mikroskop stereoskopowy	Olympus	SZ61	Przeszczep guza
Stereoskop fluorescencyjny	Olympus	SZX16	Obrazowanie przeszczepów nowotworów
Kamera mikroskopowa	Olympus	Zobacz materiał DP-72	Obrazowanie przeszczepów nowotworów
inkubator	Dowolna marka handlowa		Utrzymanie zarodków, rozgrzewka płytki iniekcyjnej
N2	Dowolna marka handlowa		Do konfiguracji mikrowtryskiwacza
Szklana kapilara (bez filamentu)	Światowe instrumenty precyzyjne	TW120-4	Przeszczep guza
Ściągacz do igieł	Instrumenty Sutter	Zobacz materiał P-97	Przeszczep guza
Końcówki do mikroładowarek	Eppendorf	930001007	Przeszczep guza
Mikrowtryskiwacz	Aparatura Harvarda	PLI-90	Przeszczep guza
Trikaina-S (MS-222)	Zachodnia Chemia	TRS1	Przeszczep guza, znieczulenie
Agarozy	Denville	Zobacz materiał CA3510-8	Wykonanie płyty wtryskowej
kuchenka mikrofalowa	Dowolna marka handlowa		Wykonanie płyty wtryskowej
skala	Dowolna marka handlowa		Wykonanie płyty wtryskowej
rękawiczki	Dowolna marka handlowa		Wszystkie aspekty protokołu
Pronaza	Diagnostyka Roche	11459643001	Zarodki z destrukcją,
żyletka	Rybak termiczny	Numer katalogowy: 12640	Przygotowanie igieł
Zlewka 50 ml (średnica 2 cale)	Dowolna marka handlowa		Wykonanie płyty wtryskowej
Szklany pojemnik	Dowolna marka handlowa		Wykonanie płyty wtryskowej
Błękit metylenowy	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M9140	Dodaj do wody z jajek, aby zapobiec rozwojowi grzybów

powiedział: powiedział: powiedział: