Indukcja glejaka za pomocą transpozycji za pośrednictwem SB: technika generowania nowego modelu myszy przy użyciu integracji plazmidu SB za pośrednictwem transpozonu z mózgiem noworodka myszy

Streszczenie

Źródło: Calinescu, A. A. et al. Ten film opisuje skuteczną technikę wywoływania glejaków (GBM) za pomocą transpozonu DNA wstrzykiwanego do komór noworodków myszy. Komórki strefy podkomorowej, które pobierają plazmid, przekształcają się, namnażają i generują guzy o charakterystyce histopatologicznej ludzkiego GBM.

Protokół

1. Zastrzyki dokomorowe u noworodków

1. Trzy do czterech tygodni przed eksperymentem ustaw klatkę hodowlaną myszy z jednym samcem i jedną samicą myszy oraz plastikowym kolorowym igloo. Zapewnia to wzbogacone środowisko i pomaga w procesie krycia.
2. Gdy ciąża zostanie potwierdzona, przenieś samca do nowej klatki. Osiemnaście dni po kryciu codziennie monitoruj klatkę pod kątem porodu. Wykonać iniekcje dokomorowe w 1. dobie po urodzeniu (P1).
3. Przygotowanie roztworu do wstrzykiwań.
   UWAGA: Roztwór do wstrzykiwań wytwarza się przez zmieszanie plazmidowego DNA z odczynnikiem do transfekcji w celu wytworzenia cząstek do transfekcji. Poniżej znajduje się przykład przygotowania roztworu do wstrzykiwań z użyciem plazmidu kodującego transpozazę Śpiącej Królewny i lucyferazy: pT2/SB100x-Luc oraz dwóch plazmidów transpozonowych: pT/CAGGS-NRASV12 i pT/CMV-SV40-LgT, w stosunku 1:2:2. Wszystkie plazmidy mają stężenie 2 μg/μL.
   1. Przygotować roztwór DNA, dodając: 4 μg (2 μL) pT2/SB100x-Luc, 8 μg (4 μL) pT/CAGGS-NRASV12 i 8 μg (4 μL) pT/CMV-SV40-LgT i 10 μL 10% glukozy do końcowej objętości 20 μL o stężeniu 1 μg/ml DNA i 5% glukozy.
   2. Przygotuj roztwór PEI, dodając 2,8 μl PEI in vivo jet, 7,2 μl sterylnej wody i 10 μl 10% glukozy do końcowego stężenia 5% glukozy.
   3. Dodać roztwór PEI do roztworu DNA, wymieszać i odstawić w temperaturze pokojowej (RT) na 20 minut. Roztwór jest teraz gotowy do wstrzyknięcia. Po jednej godzinie w temperaturze pokojowej trzymaj roztwór na lodzie.
   4. Włożyć do mikropompy czystą strzykawkę o pojemności 10 μl wyposażoną w igłę podskórną o sile 30 g i skosie 12,5° (Rysunek 1 #1).
4. Aby sprawdzić prawidłowe działanie systemu iniekcyjnego, należy użyć automatycznego wstrzykiwacza (Rysunek 1 #1), aby pobrać 10 μl wody do strzykawki, a następnie całkowicie opróżnić strzykawkę.
5. Schłodzić stadium stereotaktyczne noworodka (Rysunek 1 #3) zawiesiną suchego lodu i alkoholu do temperatury 2–8°C.
6. Wywołaj znieczulenie, umieszczając szczenięta na mokrym lodzie na 2 minuty. Znieczulenie będzie kontynuowane na schłodzonej ramie stereotaktycznej przez pozostałą część zabiegu. Utrzymanie temperatury ramy powyżej zera, w zakresie 2–8 °C, zapobiegnie oparzeniom termicznym. Jako szczególny środek ostrożności szczenięta można owinąć gazą przed umieszczeniem na mokrym lodzie.
7. Napełnić strzykawkę roztworem DNA/PEI.
8. Unieruchomić szczeniaka w ramie stereotaktycznej, umieszczając jego głowę między nausznikami pokrytymi gazą (ryc. 1b). Upewnij się, że grzbietowa strona czaszki jest pozioma, równoległa do powierzchni ramy i że szwy czaszkowe są wyraźnie widoczne. Przetrzyj głowę 70% etanolem.
9. Opuścić igłę strzykawki i wyregulować współrzędne stereotaktyczne za pomocą pokręteł ramy stereotaktycznej, aż igła dotknie lambdy (przecięcie linii środkowej kości ciemieniowej i potylicznej) (ryc. 1b).
10. Podnieś igłę i ustaw współrzędne stereotaktyczne na 0,8 mm boczny i 1,5 mm rostralny do lambdy (rysunek 1b).
11. Opuść igłę, aż dotknie skóry i lekko ją wgłębi. Zmierz współrzędne. Opuścić igłę o kolejne 1,5 mm. Igła przebije skórę i czaszkę i przejdzie przez korę, aby wejść do komory bocznej (ryc. 1c).
12. Za pomocą automatycznego wstrzykiwacza wstrzyknąć 0,75 μl roztworu DNA/PEI z szybkością 0,5 μl/min.
13. Trzymaj szczenię na ramie przez kolejną minutę, aby roztwór mógł rozproszyć się w komorach. W międzyczasie znieczulij inne szczenię na lodzie przez 2 minuty, przygotowując się do następnego wstrzyknięcia.
14. Delikatnie i powoli podnieś igłę i umieść szczeniaka pod lampą grzewczą. Monitoruj oddech i aktywność. W razie potrzeby zapewnij delikatną stymulację kończyn aż do pierwszego oddechu.
15. Zwróć szczenię matce po tym, jak się rozgrzeje, osiągnie różowy kolor, regularnie oddycha i jest aktywne, zwykle 5-7 minut. Jeśli wstrzykuje się więcej niż jedno młode na raz, należy trzymać wszystkie młode razem, aż wszystkie wstrzyknięcia zostaną wykonane. Jeśli wstrzyknięcia trwają dłużej niż 30 minut, połowę szczeniąt należy zwrócić po pierwszych 30 minutach, a resztę po zakończeniu zabiegu.
16. Monitoruj, czy matka reaguje i pielęgnuje swoje młode. W razie potrzeby dodaj do klatki zastępczą mamę.
17. Upewnij się, że przerwa między umieszczeniem szczeniaka na lodzie a umieszczeniem go pod ogrzewaniem lamp jest krótsza niż 10 minut. Im szybsza procedura, tym lepsze przeżycie. Zwykle czas potrzebny na znieczulenie i wstrzyknięcie szczeniaka wynosi 4 minuty.

Wyniki

Rycina 1: Konfiguracja eksperymentalna i wytyczne dotyczące wstrzyknięć dokomorowych u nowonarodzonych myszy. orazRamka stereotaktyczna (2) z tarczami mikrometrycznymi jest wyposażona w automatyczny wstrzykiwacz zawierający strzykawkę o pojemności 10 μl (4). Wewnątrz ramy U bezpiecznie zamocowana jest rama adaptera dla noworodków (3). Panel sterowania automatycznego wtryskiwacza (1)...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Standard laboratoryjny Stoelting z adapterami dla szczurów i myszy	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 51670	Inne firmy produkują podobne ramki, każda z nich z małymi adapterami myszy jest odpowiednia
Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego (QSI)	Stoelting (Stoelting)	Numer katalogowy: 53311	Iniekcje mogą być wykonywane bez niego, ale automatyczny wtryskiwacz pozwala na zwiększenie powtarzalności i wygody
Ręcznie montowana strzykawka MICROLITR serii 10 μL 700	Hamilton	wzoru 701	Ten model strzykawki niezawodnie dostarcza od 0,5 do 500 μl roztworu. Można również użyć innych strzykawek (na przykład 5 μl, model 75)
Igła podskórna o rozmiarze 30 (1,25", skos 15^{o})	Hamilton	S/O# 197462	Ta igła jest idealna do przekłuwania skóry i czaszki nowonarodzonej myszy bez konieczności wykonywania innych inwazyjnych zabiegów. Jeśli stanie się matowy (nie wnika łatwo w skórę), należy go wymienić.
Dysza PEI in vivo	Transfekcja Polyplus	201-10G	Podwielokrotność porcjować w małych objętościach i przechowywać w temperaturze -20ºC
D-lucyferyna, sól potasowa	Goldbio.com	SzczęścieK-1g	Inne źródła lucifierazy świetlików są równie adekwatne
Roztwór hematoksyny, modyfikowany przez Harrisa	Sigma Aldrich	HHS128-4L