$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Sekcja
UWAGA: Sterylne warunki nie są wymagane, chyba że naczynia są używane do hodowli komórek. Przygotować roztwory naczyń izolacyjnych: B1, dodać 1,5 ml HEPES 1M do 150 ml HBSS; B2, dodać 3,6 g dekstranu do 20 ml witaminy B1; B3, dodać 1 g BSA do 100 ml witaminy B1.
- Przygotować zlewkę o pojemności 150 ml z 20 ml witaminy B1. Przechowywać na lodzie i przykryć parafilmem, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.
- Głęboko znieczul mysz pod kapturem za pomocą małego ręcznika papierowego nasączonego 1 ml czystego izofluranu, który dodaje się do klatki. Znieczulenie weryfikuje się brakiem reakcji na uszczypnięcie palca u nogi. Zabij mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.
nuta: Kroki te są realizowane zgodnie z przepisami krajowymi i instytucjonalnymi.
- Opcjonalnie: Wykonaj perfuzję dosercową z 20 ml PBS 1x, aby wyeliminować zawartość krwi.
- Przekrój skórę skalpelem od szyi do nosa i odciągnij ją. Usuń wszystkie zanieczyszczające włoski za pomocą PBS 1x.
- Aby otworzyć czaszkę, najpierw włóż nożyczki z przodu do opuszki węchowej i otwórz nożyczki, aby rozerwać czaszkę na dwie części.
- Ostrożnie usuń mózg za pomocą szpatułki do mózgu. Wypreparuj splot naczyniówkowy z komór bocznych, ponieważ mogłyby one zanieczyścić preparat naczyń krwionośnych.
nuta: Opcjonalnie: Końcowe przygotowanie będzie zawierało naczynia miąższowe i opony mózgowe. Jeśli nie jest to pożądane, opony można odkleić.
- Przenieś mózg do zlewki zawierającej roztwór B1 na lodzie. Jednocześnie można leczyć do 8 mózgów.
2. Homogenizacja tkanki mózgowej
- Za pomocą dwóch skalpeli ręcznie i energicznie ubij mózg w roztworze B1, uzyskując następnie małe kawałki o wielkości około 2 mm.
- Homogenizuj preparat za pomocą automatycznego homogenizatora Dounce, wykonując 20 uderzeń przy 400 obr./min. Upewnij się, że szklana rurka jest utrzymywana w lodzie i że górna część leżaczka jest w roztworze podczas poruszania się w górę iw dół, aby zapobiec tworzeniu się kieszeni powietrznych. Jeśli przygotowanych jest kilka próbek, umyj leżaczek wodą jonizowaną między każdą homogenizacją.
3. Oczyszczanie naczynia
- Przenieść homogenat do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i przystąpić do wirowania przy 2 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na górze osadu naczynia utworzy się duży biały interfejs (głównie mielina) (czerwony, jeśli nie przeprowadzono perfuzji).
- Odrzucić supernatant. Osad naczynia i biały interfejs pozostaną ze sobą połączone. Dodaj 20 ml lodowatego roztworu witaminy B2 i potrząsaj probówką ręcznie i energicznie przez 1 minutę.
- Przejść do drugiego wirowania przy 4 400 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Mielina utworzy teraz gęstą białą warstwę na powierzchni supernatantu.
- Ostrożnie oderwij warstwę mieliny od ścianek rurki, przytrzymując rurkę i powoli ją obracając, aby supernatant mógł przejść wzdłuż ścianek. Odrzucić mielinę z supernatantem. Osad zawierający naczynia pozostaje przymocowany na dnie tuby.
- Osusz wewnętrzną ściankę probówki chłonnym papierem owiniętym wokół plastikowej pipety o pojemności 5 ml i usuń wszystkie pozostałe płyny, unikając dotykania osadu w naczyniu. Trzymaj probówkę do góry nogami na chłonnym papierze, aby spuścić pozostały płyn.
- Zawiesić osad w 1 ml lodowatego roztworu witaminy B3, pipetując w górę i w dół za pomocą końcówek o niskim stopniu wiązania, utrzymując probówkę na lodzie, a następnie dodać kolejne 5 ml roztworu witaminy B3. Upewnij się, że naczynia są jak najbardziej rozproszone i nie tworzą agregatów.
4. Filtracja
- Przygotować zlewkę na lodzie z 30 ml lodowatego roztworu witaminy B3. Przykryj parafilmem, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.
- Umieścić filtr o siatkowej siatce 20 μm na zmodyfikowanym uchwycie filtra na górze kolby Beckera i zrównoważyć, nakładając 10 ml lodowatego roztworu B3
.
- Wylej preparat naczyniowy na filtr i przepłucz naczynia 40 ml lodowatego roztworu B3.
- Odzyskać filtr za pomocą czystych kleszczyków i natychmiast zanurzyć go w zlewce zawierającej roztwór B3. Odłącz naczynia od filtra, delikatnie nim potrząsając.
- Wlać zawartość zlewki do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.
nuta: Alternatywnie, zawiesinę naczyń mózgowych z kroku 3.6 można przefiltrować do filtra o siatce 100 μm. W tym przypadku większe naczynia są preferencyjnie zatrzymywane na filtrze, podczas gdy przepływowy zawiera mikronaczynia (głównie kapilary), które są następnie filtrowane na filtrze o siatce 20 μm, jak powyżej.
- Zawiesić osad z mikronaczyń w 1 ml lodowatego roztworu B3 i przenieść go pipetując do 1,5 ml probówki Eppendorfa. Wirować przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.