Artykuł metodologiczny

Test fagocytozy in vitro: metoda oparta na obrazowaniu na żywo do badania fagocytozy synaptosomy w czasie rzeczywistym za pośrednictwem astrocytów

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Byun, Y. G., Chung, W. S. Nowatorski test obrazowania na żywo in vitro fagocytozy za pośrednictwem astrocytów przy użyciu synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH. J. Vis. Exp. (2018)

W tym filmie oceniamy zdolność fagocytarną oczyszczonych astrocytów in vitro za pomocą testu obrazowania na żywo. Test służy jako skuteczna platforma przesiewowa do identyfikacji związków chemicznych, które mogą zwiększać lub hamować zdolność fagocytarną astrocytów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Test obrazowania na żywo fagocytozy (Rysunek 1)

  1. Przygotuj 24-dołkową płytkę (lub dowolną płytkę/naczynie przygotowane do obrazowania na żywo), w której astrocyty zlewają się (ogólnie rzecz biorąc, 7 do 10 dni inkubacji po oczyszczeniu jest idealne do stabilizacji komórek).
  2. Usunąć pożywkę z każdej studzienki i trzykrotnie przemyć studzienki 1 ml soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (DPBS) firmy Dulbecco. Aby zminimalizować narażenie na powietrze, szybko umyj studzienki.
  3. Dodaj 300 μl immunopanowanych pożywek zasadowych astrocytów (IP-ABM) z 5 μl synaptosomów sprzężonych ze wskaźnikiem pH i dodatkowymi czynnikami, takimi jak immunopanowane pożywki kondycjonowane astrocytami (IP-ACM), które mogą modulować fagocytozę komórek glejowych.
  4. Inkubować płytkę w inkubatorze CO2 przez 40 minut. Ten krok pozwala synaptosomom sprzężonym ze wskaźnikiem pH osiąść na dnie płytek.
  5. Usunąć pożywkę z niezwiązanymi synaptosomami sprzężonymi ze wskaźnikiem pH i przemyć każdą studzienkę 1 ml DPBS, trzy razy.
    ostrożność: Nie prać mocno. Aby zminimalizować narażenie na powietrze, szybko umyj studzienki.
  6. Dodaj 500 μl IP-ABM z dodatkowymi czynnikami do przetestowania do studzienek.
  7. Zabierz płytkę do przyrządu do obrazowania na żywo i wybierz pozycje. Dostosuj ostrość, czas ekspozycji, jasność i moc diody LED.
    nuta: Ustawienia czasu ekspozycji, jasności i mocy diody LED są zmienne w zależności od intensywności fluorescencji i celu eksperymentu. W teście obrazowania na żywo z synaptosomami sprzężonymi ze wskaźnikiem pH zwykle ustawiamy te wartości w następujący sposób: ekspozycja: ~150–200 ms, jasność: 15 i moc diody LED: 4–6.
  8. Ustaw format obrazu, interwał czasu i całkowitą liczbę cykli obrazowania na żywo. Ustaw przedział czasowy na 1 lub 2 godziny w zależności od liczby wybranych pozycji. Zalecane są odstępy 2-godzinne, gdy do obrazowania na żywo wybranych jest więcej niż 150 pozycji.
  9. Rozpocznij eksperymenty z obrazowaniem na żywo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1. Schemat testu obrazowania fagocytozy na żywo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
pHrodo czerwony, ester sukcynimidylowy Sondy molekularne Zobacz materiał P36600Do koniugacji wskaźnika pH
Surowica płodowa bydlęca (FBS) Gibco (firma Gibco)Numer katalogowy: 16000-044
DMEM (DMEM)Gibco (firma Gibco)Numer katalogowy 11960-044
dPBS (pałeczka dPBSWelgene LB001-02
Test obrazowania na żywo w fagocytozie
Scena Juli NanoEntek
Wtyczki analizatora szeregów czasowych w wersji 3 https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fagocytoza astrocyt wizolacja synaptosom wtest z wska nikiem pHmikroskopia fluorescencyjnahodowla astrocyt wwi zanie synaptosom wformowanie fagosom wobrazowanie w czasie rzeczywistym

Powiązane artykuły