Elektroporacja ex vivo wycinków móżdżku zarodka pisklęcia: metoda wprowadzania plazmidowego DNA kodującego zielone białko fluorescencyjne w celu wizualizacji rozwoju komórek ziarnistych

Streszczenie

Źródło: Hanzel, M. et al.Ex vivo hodowla plastrów móżdżku piskląt i przestrzennie ukierunkowana elektroporacja prekursorów komórek ziarnistych.J. Vis. Exp. (2015)

W tym filmie wykonujemy elektroporację wycinków móżdżku zarodka pisklęcia za pomocą plazmidów genu reporterowego. Technika ta ułatwia wizualizację rozwoju i migracji prekursorów komórek ziarnistych do postaci warstwy ziarnistej.

Protokół

1. Elektroporacja plastrów

1. Zbuduj komorę elektroporacyjną, mocując anodę elektroporatora do podstawy szalki Petriego o średnicy 60 mm za pomocą taśmy izolacyjnej. Dodaj około 1 ml HBSS, aby przykryć elektrodę.
2. Umieść wkładkę hodowlaną 0,4 μm na elektrodzie pokrytej HBSS. Pozwól, aby wkładka hodowlana spoczywała na elektrodzie, upewniając się, że zawsze jest kontakt między wkładką a elektrodą.
   nuta: W tej konfiguracji wkładka hodowlana z plastrami będzie spoczywać na powierzchni roztworu, utrzymując obwód, ale umożliwiając przestrzenne ukierunkowanie katody.
3. Przenieść zidentyfikowane wycinki (do pięciu na wkładkę hodowlaną) do wkładki hodowlanej za pomocą pipety Pasteura o pojemności 3 ml z odciętą końcówką. Oddzielić i pozostawić do osadzenia się na wkładce hodowlanej w orientacji strzałkowej.
4. Za pomocą pipety usuń nadmiar HBSS, aby plastry nie były już skąpane w roztworze.
5. Używając końcówki do pipety P10, odpipetuj DNA (w stężeniu 1 μg/μl) rozcieńcz 20% szybką zielenią na powierzchni docelowego obszaru plasterka. 20% fast green zapewnia lepki roztwór DNA i zapobiega zbyt szerokiemu rozproszeniu DNA. Dodać około 5 μl DNA/szybko zielonego roztworu do każdej warstwy (ryc. 1B).
6. Umieść katodę na żądanej tkance docelowej i poddaj elektroporację impulsom 3 x 10 V, o czasie trwania 10 ms. Unikaj bezpośredniego kontaktu katody z tkanką. Zamiast tego wykorzystaj napięcie powierzchniowe cieczy, aby utrzymać przewodność (umieść katodę jak najbliżej tkanki, nie dotykając jej).
7. W razie potrzeby powtórz dostarczanie DNA i elektroporację do wielu regionów EGL na każdym pojedynczym wycinku móżdżku.
8. Po zakończeniu elektroporacji przenieść kulturę bakterii na szalkę Petriego o średnicy 30 mm.
9. Do każdej kultury dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej (Basal Medium Eagle, 0,5% (w/v) D-(+)-glukozy, 1% suplementu B27, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny) pod wkładką hodowlaną tak, aby wkładka hodowlana stykała się z podłożem, ale plastry nie były w niej kąpane.
10. Inkubować kultury w temperaturze 37 °C/6% CO₂ przez okres do 3 dni. Wymieniaj całą pożywkę hodowlaną co 24 godziny na świeżą, wstępnie podgrzaną pożywkę.
11. Po przeprowadzeniu hodowli utrwalić plastry na wkładkach hodowlanych na 1 godzinę w 4% paraformaldehydzie (lub O/N w temperaturze 4 °C) w świeżym naczyniu o średnicy 30 mm bez pożywki hodowlanej.

Wyniki

Rysunek 1. Ustawienie komory elektroporacyjnej. (A) Zdjęcie komory elektroporacyjnej wykonanej na zamówienie. Komora składa się z anody elektroporatora umieszczonej bezpiecznie na podstawie szalki Petriego o średnicy 60 mm. Naczynie zawiera około 1 ml HBSS do przykrycia elektrody. Wkładka hodowlana powinna spoczywać na elektrodzie ze stałym kontaktem między wkładką ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podstawowy średni orzeł (Gibco)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 41010-026
L-glutamina	Sigma	Klasa G7513
Penicylina/Streptomycyna	Sigma	Zobacz materiał P4333
Wkładka hodowlana 0,4 μm	Milipory	PICM0RG50
Elektroporator TSS20 Ovodyne	Intracel	01-916-02	Do elektroporacji należy użyć 3 impulsów 10 V 10 ms.

powiedział: