$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Sekcja móżdżku i przygotowanie sekcji (czas ćwiczeń ≈ 15–20 minut na zwierzę)
- Umieścić jedną z 60-milimetrowych szalek do hodowli komórkowych zawierających lodowatą pożywkę separacyjną pod mikroskopem dwuokularowym i zdjąć górną płytkę.
- Przetrzyj sierść głowy 70% etanolem (ostrożnie unikając dotykania oczu zwierzęcia) i odetnij głowę zwierzęcia dużymi ostrymi nożycami, zgodnie z zatwierdzoną procedurą.
UWAGA: Wycinki móżdżku są generowane z myszy P9-P10 bez określonego odchylenia płciowego lub szczepu.
- Użyj małych nożyczek, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej głowy, zaczynając od szyi i idąc w górę do pyska myszy.
- Aby przytrzymać głowę i odsłonić czaszkę, odchyl skórę brzusznie pod głową i ściśnij dwa fałdy skóry między palcami.
- Delikatnie włóż małe nożyczki do otworu wielkiego i przetnij czaszkę, wykonując jedno boczne nacięcie w bok, a następnie przetnij wokół czaszki głowy. Podczas cięcia trzymaj czubek nożyczek jak najbardziej równolegle i blisko czaszki, aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.
- Odzyskaj grzbietową część czaszki za pomocą drobno prostych kleszczy. Ostrożnie unosząc grzbietową część czaszki, w razie potrzeby przetnij przylegające opony mózgowe (półprzezroczystą nawadnianą błonę otaczającą tkankę mózgową), aby uniknąć uszkodzenia tkanki mózgowej.
- Ostrożnie wprowadź drobno-proste kleszcze (lub alternatywnie użyj szpatułki) między brzuszną czaszkę a mózg, delikatnie odwróć mózg i przetnij nerwy wzrokowe i trójdzielne małymi nożyczkami.
- Pomóż mózgowi opaść grawitacyjnie do naczynia do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm zawierającego lodowatą pożywkę do preparacji, obracając głowę do góry nogami tuż nad naczyniem i w razie potrzeby uwalniając ostatnie zrosty małymi nożyczkami.
- Za pomocą cienkich kleszczy zorientuj mózg tak, aby strona grzbietowa była skierowana w stronę badacza, a strona brzuszna leżała na dnie naczynia.
- Pod mikroskopem lornetkowym użyj cienkich, prostych kleszczy, aby unieruchomić mózg po stronie przodomózgowia i unikaj dotykania tyłomózgowia, ponieważ może dojść do uszkodzenia. Oddziel tyłomózgowie od reszty mózgu (przodomózgowie i śródmózgowie, patrz schemat na rysunku 1Aa), używając drobno prostych kleszczy. Aby oddzielić móżdżek od reszty tyłomózgowia, użyj cienkich kleszczy, aby przeciąć szypułki móżdżku pod móżdżkiem (patrz schemat na rysunku 1Aa').
- Po wyizolowaniu móżdżku ostrożnie oderwij opony mózgowe za pomocą drobno prostych kleszczy (patrz schemat na rysunku 1Aa').
- Delikatnie przytrzymaj móżdżek za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczyków i umieść go grzbietem do góry na plastikowej platformie prostopadle do ostrza maszynki do golenia (patrz schemat na rysunku 1Bb).
- Nadmiar pożywki preparacyjnej wokół móżdżku należy odessać za pomocą sterylnej końcówki pipety z cienkim końcem dostosowanej do pipety o pojemności 1 ml (patrz schemat na rysunku 1Bb).
- Upewnij się, że móżdżek leży płasko, ale nie jest rozciągnięty, po umieszczeniu na platformie, aby uzyskać optymalne plastry strzałkowe podczas cięcia (patrz schemat na rysunku 1Bb).
- Pokrój strzałkowe odcinki móżdżku o grubości 300 μm za pomocą rozdrabniacza tkanek (patrz schemat na rysunku 1Bb'). Siła i prędkość ostrza muszą być zoptymalizowane na miejscu.
- Delikatnie dodaj kroplę pożywki preparacyjnej na pokrojony móżdżek. Używając końcówki pipety o szerokim otworze umieszczonej na pipecie o pojemności 1 ml, powoli odessać pokrojony móżdżek i przenieść go z powrotem do 60-milimetrowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej lodowato zimne podłoże preparacyjne (patrz schemat na rysunku 1Bb'').
- Wyczyść plastikową platformę rozdrabniacza tkanek 100% etanolem między każdym krojeniem móżdżku. Pozwól, aby etanol odparował przed umieszczeniem następnego móżdżku na platformie.
- Użyj dwóch drobno prostych kleszczyków (lub alternatywnie tytanowych igieł), aby oddzielić poszczególne plastry i wybierz 6–8 plasterków z robaka (patrz schemat na rysunku 1Cc i 1Cc').
- Weź 6-dołkową płytkę z wkładkami hodowlanymi i przenieś do 4 wybranych wycinków na jedną wkładkę hodowlaną wraz z odrobiną pożywki preparcyjnej, używając końcówki pipety o szerokim otworze dostosowanej do pipety o pojemności 1 ml (patrz schemat na rysunku 1Cc').
- Umieść plastry na środku wkładki hodowlanej, używając pożywki do preparowania lub kleszczy, aby delikatnie popchnąć i pociągnąć je we właściwe miejsce, unikając ich kontaktu ze sobą (patrz schemat na rysunku 1Cc').
- Usuń nadmiar pożywki preparacyjnej wokół plastrów za pomocą cienkiej końcówki pipety. Upewnij się, że plastry leżą płasko na membranie (patrz schemat na rysunku 1Cc').
- Umieścić płytkę 6-dołkową w inkubatorze natychmiast po dodaniu plastrów do membrany.
