Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie kultury plastrów
- Przygotuj mysie organotypowe kultury plastrów hipokampa przy użyciu postnatalnych myszy w wieku od 6 do 7 dni dowolnej płci.
- Przygotować pożywki preparacyjne do organotypowej hodowli plastrów składających się z (w mM): 238 sacharozy, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 i 11 glukozy w wodzie dejonizowanej, a następnie gaz z 5% CO2/95% O2 do pH 7,4.
- Przygotować organotypową pożywkę hodowlaną w warstwach składającą się z: 78,8% (v/v) minimum niezbędnego podłoża Eagle, 20% (v/v) surowicy końskiej, 17,9 mM NaHCO3, 26,6 mM glukozy, 2 M CaCl2, 2 MMgSO4, 30 mM HEPES, insuliny (1 μg/ml) i 0,06 mM kwasu askorbinowego o pH dostosowanym do 7,3. Dostosuj osmolarność do 310–330 osmol za pomocą osmometru.
- Wypreparuj hipokampy z całego mózgu za pomocą dwóch szpatułek i pokrój (400 μm) za pomocą rozdrabniacza tkanek. Oddzielić plastry za pomocą dwóch kleszczyków i przenieść do 30-milimetrowych wkładek do hodowli komórkowych na 6-dołkowej płytce wypełnionej pożywką hodowlaną (950 μl) pod wkładkami.
- Organtypowe kultury bakterii w warstwach należy przechowywać w inkubatorze do hodowli tkankowych (35°C, 5% CO2 ) i zmieniać pożywki do hodowli plastrów co dwa dni.
2. Przygotowanie plazmidu
- Przygotuj plazmid dla interesującego Cię genu.
- Subklonuj gen białka zielonej fluorescencji (EGFP) do wektora pCAG.
- Oczyść plazmid pCAG-EGFP za pomocą zestawu do oczyszczania bez endotoksyn i rozpuść w roztworze wewnętrznym, który składa się z wody uzdatnionej pirowęglanem dietylu zawierającej 140 mM K-metanosulfonianu, 0,2 mM EGTA, 2 mM MgCl2 i 10 mM HEPES, dostosowanego do pH 7,3 za pomocą KOH (stężenie plazmidu: 0,1 μg / μL).
3. Przygotowanie pipet szklanych
- Pociągnij pipety ze szkła borokrzemianowego (4,5–8 MΩ) na ściągaczu do mikropipet (Rysunek 1A).
nuta: Szklane pipety używane do nagrań z użyciem clampów krosowych dla całych komórek są idealne do elektroporacji.
- Piecz szklane pipety przez noc w temperaturze 200°C w celu sterylizacji.
- Sprawdź rozmiar końcówki pipety pod mikroskopem preparacyjnym, aby w przybliżeniu określić opór elektryczny.
- Opcjonalnie: Sprawdź rezystancję pipety, podłączając ją do elektrody elektroporacyjnej i za pomocą mikromanipulatora wmanewruj końcówkę pipety w sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (aCSF) sterylizowany filtrem (aCSF) zawierający (w mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 i 11 glukozę w wodzie dejonizowanej, gazowanej 5% CO2 / 95% O2do pH 7,4. Potwierdź rzeczywistą rezystancję za pomocą odczytu na elektroporatorze.
nuta: Im ostrzejsza końcówka pipety, tym większy opór elektryczny. Rezystancja pipety powinna być mniejsza niż 10 MΩ. Szklane pipety o wysokiej rezystancji (ilustracja 1B) często zapychają końcówkę podczas wielokrotnej elektroporacji.
4. Konfiguracja urządzenia do elektroporacji
- Zainstaluj elektroporator na standardowym stanowisku do elektrofizjologii całych komórek, wyposażonym w pionowy mikroskop zamontowany na ruchomym stole z mikromanipulatorem i pompą perystaltyczną.
- Zamontuj stopień główny elektroporatora na mikromanipulatorze i podłącz parę głośników do elektroporatora. Podłącz elektroporator do pedału nożnego, który może być użyty do wysłania impulsu, gdy będzie gotowy.
nuta: Po włączeniu głośniki emitują dźwięk, który jest wskaźnikiem oporu elektrycznego na elektrodzie. Umożliwia to określenie względnych zmian oporności bez odwracania uwagi od zabiegu.
5. Przygotowanie do elektroporacji
- Przenieś wkładki do kultur plastrowych z płytek 6-dołkowych na 3-centymetrowe szalki Petriego załadowane 900 μl pożywki hodowlanej i przechowuj w stołowym inkubatorze CO2 do momentu, gdy będą gotowe do przeprowadzenia elektroporacji.
- Wstępnie inkubować świeże wkładki hodowlane z pożywką hodowlaną w plastrach (1 ml) przez co najmniej 30 minut na 3,5 cm szalce Petriego w celu wyhodowania plastrów po elektroporacji.
- Oczyść i przygotuj zestaw do elektroporacji.
- Wypełnij linie 10% wybielaczem przez 5 minut, aby wysterylizować rurkę i komorę przed rozpoczęciem eksperymentu na cały dzień.
- Przetapiaj linie dejonizowaną wodą autoklawowaną przez co najmniej 30 minut, aby całkowicie spłukać.
- Wykonaj fuzję linii za pomocą sterylizowanego filtrem aCSF zawierającego 0,001 mM tetrodotoksyny (TTX).
nuta: TTX minimalizuje toksyczność komórkową i śmierć z powodu nadmiernego pobudzenia interneuronów.
- Ustaw parametry impulsu elektroporatora: amplituda –5 V, impuls prostokątny, ciąg 500 ms, częstotliwość 50 Hz i szerokość impulsu 500 μs.
- Napełnij szklaną pipetę 5 μl roztworu wewnętrznego zawierającego plazmid.
- Usuń wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza z końcówki pipety, kilkakrotnie przesuwając i delikatnie stukając w końcówkę.
- Sprawdzić, czy końcówka nie jest uszkodzona, wizualizując ją pod mikroskopem preparacyjnym lub powtarzając krok 3.3.1 w celu sprawdzenia oporu pipety.
nuta: Jeśli końcówka jest uszkodzona, szklaną pipetę należy wyrzucić, a krok ten należy powtórzyć z nową szklaną pipetą przygotowaną wcześniej w kroku 3.
- Mocno przymocuj końcówkę pipety do elektrody i włącz głośniki. Zapisz odczyt (rezystancję pipety) elektroporatora, gdy końcówka zetknęła się z medium aCSF.
- Przeciąć membranę wkładki hodowlanej za pomocą ostrego ostrza i wyizolować jedną kulturę plasterkową. Ostrożnie przenieś kulturę plastrów do komory elektroporacyjnej za pomocą ostrych kleszczy kątowych i utrwal jej położenie za pomocą kotwicy do plastrów.
- Nie należy trzymać kultury plastrów poza inkubatorem dłużej niż 30 minut, aby zapobiec skutkom ubocznym, takim jak zmiany w zdrowiu lub funkcji neuronów.
6. Interesujące ogniwa elektroporacyjne
- Zastosować nadciśnienie w pipecie za pomocą ust lub za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml (ciśnienie 0,2–0,5 ml) podłączonej do rurki.
- Użyj trójwymiarowego pokrętła mikromanipulatora, aby manewrować końcówką pipety w pobliżu powierzchni kultury plastrów.
- Wybierz komórkę docelową i zbliż się do niej, utrzymując nadciśnienie, aż na powierzchni komórki utworzy się wgłębienie, widoczne pod mikroskopem.
- Wykonuj cykle ciśnieniowe.
- Szybko zastosuj łagodne podciśnienie doustnie, tak aby między końcówką pipety a błoną plazmatyczną utworzyło się luźne uszczelnienie, na co wskazuje wizualnie membrana sięgająca nieco do końcówki pipety. Obserwuj wzrost (~2,5x początkowy opór) oporu pipety, nasłuchując wzrostu tonu dochodzącego z głośników. Szybko ponownie zastosuj nadciśnienie, aby wgłębienie ponownie się uformowało.
- Natychmiast wykonaj co najmniej dwa kolejne cykle ciśnieniowe bez przerwy, a następnie utrzymuj podciśnienie przez 1 s.
nuta: Przerwy między cyklami, wywieranie zbyt dużego nacisku lub utrzymywanie podciśnienia przez zbyt długi czas może spowodować znaczne uszkodzenie ogniwa i prawdopodobnie spowodować śmierć ogniwa podczas elektroporacji.
- Szybko pulsuj elektroporatorem raz za pomocą pedału nożnego, gdy ton z głośników osiągnie stabilny wierzchołek wysokości, wskazując szczytową rezystancję elektryczną. Nie czekaj na szczytową rezystancję dłużej niż 1 s przed wysłaniem impulsu.
nuta: Nie zaobserwowaliśmy żadnej elektroporacji poza celem podczas korzystania z tego protokołu. Transfekcji poddano tylko te komórki, które miały kontakt ze szklaną pipetą podczas cykli ciśnieniowych. Umieszczenie pipety w pobliżu innych neuronów nie powoduje transfekcji genu.
- Delikatnie wycofaj pipetę na około 100 μm z kuwety bez wywierania nacisku.
- Ponownie zastosuj nadciśnienie, sprawdzając, czy rezystancja jest podobna do odczytu zarejestrowanego w kroku 5.5, a następnie zbliż się do następnej komórki.
- Usunąć potencjalne zatkania, sygnalizowane wizualnie lub przez znacznie zwiększoną (o >15% wyższą) rezystancję pipety po elektroporacji, stosując nadciśnienie.
nuta: Jeśli nie ma widocznego zatkania, a opór jest nadal znacznie wyższy, wyrzuć pipetę i użyj nowej. Średnio pipeta może być używana do maksymalnie 20 zdarzeń elektroporacji, jeśli użytkownik jest ostrożny.
Po elektroporacji przenieś kulturę plastrów na świeżą wkładkę hodowlaną i inkubuj w temperaturze 35°C w inkubatorze przez okres do 3 dni.
