$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Pobieranie rdzenia kręgowego
UWAGA: Wszystkie instrumenty powinny być sterylizowane w autoklawie (135 °C i 30 psi przez 4 x 7 min cykle) dla sterylności.
- Poddaj eutanazji 1-3 jednodniowe młode myszy C57BL/6 w komorze z izofluranem. Odczekaj 30 s po ustaniu ruchu i uszczypnij nogę, aby potwierdzić brak odpowiedzi.
- Oddziel głowę od ciała nożyczkami, z szczeniakiem w pozycji leżącej.
- Ustabilizuj tylne nogi lub ogon i ramiona na stole zabiegowym, stroną grzbietową skierowaną w stronę użytkownika.
- Odetnij skórę za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki.
- Przetnij rdzeń kręgowy od odcinka lędźwiowego tuż nad biodrami i przystąp do cięcia po obu stronach klatki piersiowej, aby oddzielić ją od ciała.
nuta: Wymaga to starannego wypreparowania rdzenia kręgowego z narządów trzewnych, aby uniknąć niezamierzonego uszkodzenia innych narządów (ryc. 1a).
- Myć sekwencyjnie przez 10 s na szalkach Petriego o wymiarach 3 x 10 cm zawierających 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) o wielkości 0,2 μm w celu usunięcia nadmiaru tkanki.
- Włóż igłę 22G i strzykawkę wypełnione 5 ml wysterylizowanego przez filtr PBS do ogonowego końca kręgosłupa i przepłucz czaszkę, umożliwiając wyjście pępowiny na czwartą szalkę Petriego (ryc. 1b).
- Zebrać rdzeń kręgowy do probówki o pojemności 15 ml z 5 ml HABG (Tabela 1) na lodzie. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć zmiażdżenia rdzenia kręgowego.
- Powtórz kroki 1.1–1.8 dla każdego młodego w miocie.
nuta: Idealnie byłoby, gdyby proces ten trwał mniej niż 30 minut na rdzeń kręgowy, aby zapewnić zdrową izolację neuronów.
2. Izolowanie neuronów
UWAGA: Następujący krok powinien być wykonany w okapie z przepływem laminarnym. Oczekuje się znajomości podstawowej techniki sterylnej.
- Mielenie tkanek
- Weź rurkę zawierającą rdzeń kręgowy i lekko potrząśnij, aby zawiesić tkankę.
- Wlej chusteczkę z probówki do szklanej szalki Petriego o średnicy 60 mm i pokrój w kostkę żyletką, aby uzyskać drobne kawałki o wielkości ~0,5 mm.
- Przenieść tkankę za pomocą pipety o szerokim otworze do probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml HABG.
- Umieścić go w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C na 30 minut, aby umożliwić komórkom zrównoważenie w tej temperaturze. Trzymaj komórki na wytrząsarce tylko na tyle, aby mogły być zawieszone w płynie.
nuta: Ten krok ma na celu uniknięcie wstrząsu komórek po przeniesieniu z lodu do pożywki wytrawiającej. Utrzymywanie komórek w temperaturze 30 °C pomaga zmniejszyć śmierć komórek związaną ze zwiększonym metabolizmem w temperaturze 37 °C.
- Przygotować pożywkę do wytrawiania (tabela 1).
- Przygotować gradient gęstości (tabela 1).
- Przygotować każdą z 4 warstw w 4 oddzielnych probówkach o pojemności 15 ml, jak opisano w Tabeli 1.
- Dodaj 1 ml z każdej warstwy do nowej probówki o pojemności 15 ml. Zacznij od warstwy 1 na dole i dodawaj sekwencyjnie, aż dojdziesz do warstwy 4 na górze. Unikaj naruszania warstw podczas dodawania.
- Umyj płytki pokryte PDL. Myj sterylną wodą przez kilka minut, a następnie usuń pozostałą wodę i pozostaw do wyschnięcia na 1 godzinę.
- Przenieść tkankę do pożywki trawiącej.
- Wyjąć probówkę zawierającą tkanki z łaźni wodnej w shakerze o temperaturze 30 °C i pozostawić na kilka minut, aby się uspokoiła.
- Wyjąć probówkę z pożywką wytrawiającą z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i zassać ją do strzykawki leur-lock.
- Odessać nadmiar HABG z rurki zawierającej tkankę.
- Użyj filtra leur-lock 0,2 μm na strzykawce, aby dodać pożywkę trawiącą do rurki zawierającej tkankę.
- Umieść probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 30 °C na 30 minut. Utrzymuj komórki w potrząsaniu na tyle, aby mogły być zawieszone w płynie.
nuta: Ważne jest, aby nie trzymać komórek w pożywce trawiącej zbyt długo ani nie dopuścić do zbyt wysokiej temperatury, co może prowadzić do nadmiernego trawienia i spowodować zawieszenie tkanki w galaretowatej mieszance.
- W tym okresie pokryj lamininę.
- Wykonaj trituration (tj. oddzielenie komórek od tkanki).
- Wyjąć probówkę z wytrząsanej łaźni wodnej o temperaturze 30 °C i pozostawić na kilka minut, aby osiadła.
- Odessać nadmiar pożywki trawiennej.
- Zawiesić tkankę w 2 ml HABG.
- Za pomocą pipety o wąskim otworze rozcierać 10 razy przez 45 s.
nuta: Jest to prawdopodobnie najważniejszy krok i może znacznie zmniejszyć plony, jeśli nie zostanie wykonany prawidłowo.
- Zassać tkankę do pipety i natychmiast opróżnić zawartość z powrotem.
- Unikaj wprowadzania powietrza, ponieważ znacznie zmniejszy to żywotny plon.
nuta: Idealna pipeta to szklana pipeta o średnicy 9 cali. Końcówka pipety powinna być wypolerowana ogniowo, aby wygładzić szorstkie powierzchnie. Następnie należy go sikonikonizować poprzez umieszczenie w roztworze dichlorodimetylosilanu (DMDCS) w stosunku 1:20 w chloroformie i pozostawić O/N. Następnie pipetę należy wyjąć i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Następnie należy go sterylizować w autoklawie.
ostrożność: DMDCS i chloroform są wysoce łatwopalne, a silikonowanie powinno odbywać się w dygestorium.
- Odessać górne 2 ml supernatantu i umieścić go w nowej probówce o pojemności 15 ml oznaczonej jako "kolekcja".
- Powtórz kroki 2.7.3–2.7.5 jeszcze dwa razy (pod koniec probówka do pobierania komórek powinna mieć 6 ml).
- Powoli przenieś zawartość probówki zbiorczej do probówki gradientowej przygotowanej w kroku 2.2, unikając zakłócenia gradientu.
- W tym momencie wyjąć z lodówki wcześniej przygotowaną pożywkę neurobazalną (Tabela 1) i pozostawić do ogrzania w łaźni o temperaturze 37 °C.
- Oczyść neurony.
- Odwirować probówkę gradientową przez 15 minut w temperaturze 800 x g i temperaturze 22 °C.
- Zebrać żądaną warstwę (warstwy) za pomocą pipety (Rysunek 2) i umieścić w nowej probówce o pojemności 15 ml. Aby uzyskać izolację neuronów o najwyższej czystości (tj. >90%), zbierz warstwę 3. Aby uzyskać większy plon przy mniejszej czystości (tj. >70–80%), zbierz warstwy 2 i 3.
- Rozcieńczyć gradient gęstości, dodając 5 ml HABG do nowo zebranych warstw.
- Wirować przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze 22 °C.
- Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić w 5 ml HABG i strzepnąć osad, aby zawiesić komórki.
- Wirować przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze 22 °C.
- Wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić w 3 ml podłoża neurobazalnego i strzepnąć osad w celu ponownego zawieszenia komórek.
| media | składowanie | Składniki | preparat |
| HABG | 4 °C/24h | | 100 ml | - Rozmrozić B27 w 4 °C lodówka O/N
- Sterylizacja filtra (0,22 μm) |
| Hibernacja A | 97,8 ml |
| B27 [2%] | 2 ml |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml |
| Neuropodstawowe media | 4 °C/1 tydzień | | 100 ml | - Rozmrozić B27 w lodówce 4 °C O/N
- Sterylizacja filtra (0,22 μm)
- Porcje po 50 ml rozlać do probówek o pojemności 50 ml (przechowywać w temperaturze 4 °C) |
| Neuropodstawowy A | 97 ml |
| B27 [2%] | 2 ml |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 ml |
| Pióro/paciorkowiec [1%] | 1 ml |
| Pożywka mineralna | Dzień izolacji | | 10 ml | - Energicznie wstrząsnąć
- Pozostaw w kąpieli w temperaturze 37°C na 30 minut (najlepiej przygotować 30 minut przed użyciem)
- Sterylizacja filtra (0,22 μm) |
| HA-CA | 10 ml |
| papaina | 25 mg |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 ml |
| Gradient gęstości | Dzień izolacji | | 1 Gradient | |
| Warstwa | Przygotowanie do pracy | HABG (Język angielski) |
| (0,13 ml) | (5,29 ml) |
| 1 Dół | 0,26 ml | 1,24 ml |
| cyfra arabska | 0,19 ml | 1,31 ml |
| 3 | 0,15 ml | 1,35 ml |
| 4 Do góry | 0,11 ml | 1,39 ml |
Tabela 1: Przygotowanie mediów i rozwiązań używanych w tym protokole.
