Decelularyzacja kompleksu krążeniowo-oddechowego: technika decelularyzacji serca i płuc na podstawie modelu mysiego

Abstract

Źródło: Mayorca-Guiliani, A. E. et al. Decelularyzacja mysiego kompleksu krążeniowo-oddechowego. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film demonstruje metodę wytwarzania decelularnych rusztowań z matrycy zewnątrzkomórkowej lub ECM poprzez zastosowanie perfuzji detergentów przez układ krwionośny. Strukturalne rusztowania ECM mogą być następnie wykorzystane do analizy przebudowy ECM związanej z chorobą krążeniowo-oddechową.

Protocol

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Mikrochirurgia pośmiertna

1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą komory CO₂.
   1. Umieść mysz w komorze o pojemności 4 l i zacznij napełniać ją 100% CO₂, zaczynając od 0,2 l/min przez 2 min, zwiększając aż do osiągnięcia przepływu 0,8 l/min po 3 min. Mysz powinna stracić przytomność w ciągu pierwszych 2 minut, a następnie oddychanie powinno ustać (zwykle około 5 min, ale przepływ można utrzymać w razie potrzeby). Potwierdź śmierć przed przejściem do następnego kroku.
2. Ogol klatkę piersiową, brzuch i grzbiet myszy maszynką do strzyżenia włosów i zdezynfekuj 70% etanolem. Golenie znacznie zmniejsza liczbę artefaktów spowodowanych obecnością włosów na próbkach do obrazowania lub analizy biochemicznej.
3. Przypnij mysz do styropianowej tacy, wysuwając jej przednie i tylne kończyny, a także głowę i ogon. Umieść go pod mikroskopem mikrochirurgicznym.
4. Za pomocą nożyczek Mayo z prostym wzorem ustal dostęp chirurgiczny z nacięciem skóry biegnącym od okolicy podżuchwowej do dolnej części brzucha i wypreparuj podskórnie, aby odsłonić ścianę klatki piersiowej i otrzewną.
5. Za pomocą nożyczek mikrochirurgicznych przetnij mięśnie piersiowe większe i piersiowe mniejsze wzdłuż szóstej przestrzeni międzyżebrowej po obu stronach ściany klatki piersiowej.
6. Za pomocą nożyczek o prostym wzorze przetnij mostek wzdłuż poprzednich nacięć, a następnie zakończ sternotomię, przecinając mostek wzdłuż jego długiej osi, a następnie podnieś i przypnij obie strony ściany klatki piersiowej, aby odsłonić kompleks krążeniowo-oddechowy.
7. Za pomocą mikrokleszczyków z okrągłą końcówką (lub mikrokleszczyków Dumonta) wyciąć grasicę i otaczającą ją tkankę tłuszczową, delikatnie ściągając je z przyczepów. To ujawni główne statki.
8. Za pomocą kauteryzacji kauteryzuj zstępującą żyłę jamy i za pomocą nożyczek o prostym wzorze przetnij przełyk.
9. Za pomocą ostrych mikrokleszczy oddziel żyły ramienno-głowowe i tętnice ramienno-głowowe, lewą tętnicę szyjną wspólną i lewą tętnicę podobojczykową od leżącej poniżej tkanki, aby ułatwić podwiązanie i kauteryzację.
10. Za pomocą uchwytu mikroigłowego, ostrych mikrokleszczyków i szwu 9-0 umieść szwy powyżej pojawienia się tętnicy ramienno-głowowej, lewej tętnicy szyjnej wspólnej i lewej tętnicy podobojczykowej.
11. Kauteryzuj żyły ramienno-głowowe.
12. Oddziel gruczoły ślinowe podżuchwowe wzdłuż linii środkowej, aby odsłonić mięśnie szyi i tchawicę. Oddziel mięśnie, aby odsłonić więzadło kości sercowej tarczycy. Za pomocą mikronożyczek otwórz wejście, przecinając więzadło.
13. Wprowadzić cewnik 27 G do tchawicy i delikatnie wciskać, aż tchawica rozgałęzi się do oskrzeli (tj. do momentu napotkania oporu cewnika, a następnie wycofaj się o 3 mm). Uważaj, aby nie zakłócić działania oskrzeli. Za pomocą szwu 6-0 umieść 3 szwy wokół tchawicy, aby zabezpieczyć cewnik.
14. Przekrój mysz na wysokości 12. kręgu piersiowego. Aorta zstępująca biegnie do przodu kręgosłupa i powinna być tutaj przecięta wraz z kręgosłupem. Rozsuń dolną połowę.
15. Wstecznie cewnikuj aortę i popchnij cewnik, aż dotrze do łuku aorty. Za pomocą szwu 9-0 umieść 4 szwy wokół aorty, zaczynając 5 mm poniżej końcówki cewnika.

2. Decelularyzacja

1. Podłącz mysz do systemu pompy za pomocą silikonowych wężyków i złączy Luer. Perfuzja z wodą dejonizowaną w stężeniu 200 μl/min przez 15 min. Utrzymuj to natężenie przepływu podczas decelularyzacji.
2. Zmień środek perfuzyjny na 0,5% deoksycholan sodu (DOC) rozcieńczony w wodzie dejonizowanej i perfuzuj przez noc.
3. Zmienić środek perfuzyjny na 0,1% dodecylosiarczan sodu (SDS) rozcieńczony w wodzie dejonizowanej i perfuzjonować przez 8 godzin.
4. Perfuzję z wodą dejonizowaną przez noc, aby zmyć SDS i DOC przez 24 godziny.
5. Wyciąć pozbawione komórek serce i płuca, dzieląc ich przyczepy do klatki piersiowej za pomocą zakrzywionych nożyczek i przechowywać w sterylnej krioprobówce z dejonizowaną wodą z 1% (v/v) penicyliną-streptomycyną i 0,3 μM azydkiem sodu w temperaturze 4 °C. Rusztowania ECM mogą być przechowywane przez co najmniej 12 tygodni. Jeśli rusztowanie będzie używane do analizy biochemicznej (np. spektrometrii mas), należy je zamrozić w ciekłym azocie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MIKROCHIRURGIA
6-0 szew, igła o przekroju trójkątnym (Vicryl)	Etyka	6301124
9-0 mikroszew (Safil)	B Braun	G1048611
Kleszcze Adson	Narzędzia naukowe	11006-12
Kleszczyki Adson z zębami	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 11027-12
Uchwyt na mikroigły Castroviejo	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 12061-01
Komora wentylacyjna CO2 do eutanazji myszy
Woda dejonizowana (Milli-Q IQ 7000, system wody laboratoryjnej Ultraclean)	Merck	ZIQ7000T0
Jednorazowa tacka styropianowa (~30 × 50 cm)
Mikroskop preparacyjny (Greenough, z dwuramienną gęsią szyją)	Księga Leica	S6 D
Dwustronna mikroszpatułka	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 10091-12
Mikrokleszcze Dumonta (dwa)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11252-20
Mikrokleszczyki Dumont z końcówkami 45°	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 11251-35
Maszynki do strzyżenia włosów	Oster	Nr kat. 76998-320-051
Uchwyt igły Halseya (ze szczękami z węglika wolframu)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 12500-12
Cewnik dożylny o rozmiarze 24 (Insyte)	Bd	381512
Dożylny cewnik o rozmiarze 26 (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Nożyczki majonezowe (twarde, proste)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14110-15
Mikrokleszcze z końcówkami z pierścieniem	Aesculap	FM571R
Nożyczki mikrosprężynowe (Vannas, zakrzywione)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy: 15001-08
Igły (rozmiar 27; Mikrolanca)	Bd	Numer katalogowy 21018
Ręcznik papierowy (sterylny) lub serwetka chirurgiczna
Nożyczki ząbkowane (CeramaCut, proste)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14958-09
Szpatułka (Freer-Yasargil)	Aesculap	Zobacz materiał OL166R
Strzykawki (1 ml; Plastipak)	Bd	3021001
Strzykawki (10 ml; Plastipak)	Bd	3021110
Nożyczki do ścięgien (Walton)	Narzędzia naukowe	Numer katalogowy 14077-09
DECELULARYZACJA
70% etanolu (alkohol bezwzględny 99,9%); alkohol bezwzględny należy dostosować do 70% (vol/vol) przy użyciu wody dejonizowanej	śliwka	1680766
Woda dejonizowana (Milli-Q IQ 7000, system wody laboratoryjnej Ultraclean)	Merck	ZIQ7000T0
Złączki męskie typu luer-tubing (1/8 cala)	Światowe instrumenty precyzyjne	Nr kat. 13158-100
Złączki męskie typu luer-tubing (1/8 cala)	Światowe instrumenty precyzyjne	Nr kat. 13158-100
PBS (pH 7,4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Naukowy	70011044
Penicylina-streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	15140122
Pompa perystaltyczna (z 12 kanałami)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Rurka silikonowa (o średnicy wewnętrznej 2 mm i średnicy zewnętrznej 4 mm)	Ole Dich	Numer katalogowy: 31399
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Deoksycholan sodu (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G