$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie mikropęcherzyków
- Przygotowanie mikropęcherzyków do wstrzykiwań
nuta: Asystent wykonuje ten krok, gdy rozpoczyna się "wstrzykiwanie mikropęcherzyków (MB) do zarodków". Każdy zarodek jest wstrzykiwany jednokrotnie, przy czym rodzaj mikropęcherzyków wybrany do każdego wstrzyknięcia jest losowo wybierany przez asystenta, tak aby wszystkie rodzaje mikropęcherzyków były równomiernie rozmieszczone podczas całej procedury, ale podawane w losowej kolejności. Upewnij się, że chirurg jest ślepy na rodzaj wstrzykiwanego pęcherzyka.
- Oznaczyć objętość roztworu bąbelkowego wymaganą do uzyskania końcowego stężenia 1 x 108 MB/ml w objętości 400 μl (obliczyć objętość na podstawie stężeń podstawowych). Porcję odpowiedniej objętości soli fizjologicznej przelać do pustej probówki do mikrowirówki.
- Delikatnie wymieszać wybraną fiolkę z mikropęcherzykami i pobrać nadmiar objętości (~50 μl więcej niż obliczona powyżej) roztworu do strzykawki o pojemności 1 ml za pomocą igły 21 G. Wstrzyknąć mikropęcherzyki do pustej probówki do mikrowirówki.
- Odmierzyć pipetą odpowiednią objętość roztworu podstawowego mikropęcherzyków i dodać do porcji soli fizjologicznej. Wymieszać, delikatnie mieszając końcówką pipety.
- Pobrać rozcieńczony roztwór mikropęcherzyków do czystej strzykawki za pomocą igły 21 G. Wyjmując igłę, usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza ze strzykawki i założyć luer oraz rurkę. Powoli wepchnij roztwór do końca rurki, uważając, aby nie wytworzyć żadnych pęcherzyków powietrza.
- Włożyć strzykawkę do pompy infuzyjnej strzykawki w celu dozowania mikropęcherzyków z szybkością 20 μl/min, co daje całkowitą objętość 20 μl. Przymocować wyciągniętą szklaną igłę do końca rurki. Przesunąć pompę w pobliże etapu wtrysku.
2. Wstrzykiwanie mikropęcherzyków do zarodków
- Losowo wybrać i usunąć (za pomocą perforowanej łyżki) jeden zarodek z naczynia ze schłodzoną pożywką. Umieścić w naczyniu separacyjnym znajdującym się na stoliku ultrasonograficznym pod stereoskopem i usunąć woreczek żółtkowy i błony owodniowe za pomocą cienkich kleszczy, nacinając/rozdzierając od strony, która wydaje się najmniej unaczyniona (strona antypatiometryczna). Najłatwiej to osiągnąć, przebijając obszar przylegający do obszaru głowy.
- Wytnij wystarczająco dużo, aby usunąć zarodek od wewnątrz, ale nie więcej. Ustabilizuj naczynia preparacyjne za pomocą małych kawałków plasteliny.
- Delikatnie manewruj workiem od okolic zarodka. Ułóż zarodek na boku, z łożyskiem i naczyniami pępowinowymi z przodu. Za pomocą szpilek przeciw owadom przypnij woreczek żółtkowy (zalecane 4 szpilki) i krawędzie łożyska, jeśli to konieczne, aby przymocować je na miejscu. Unikaj głównych statków.
- Umyj zarodek wstępnie podgrzanym PBS w temperaturze 45°C, aż zarodek ożyje. Zidentyfikuj żyłę pępowinową i związaną z nią sieć naczyniową. Ustawić naczynie tak, aby można było wygodnie wykonać wstrzyknięcie.
nuta: Po ogrzaniu krew w zarodku zacznie płynąć, widocznie pompując w tętnicy pępowinowej. Kiedy zacznie się przepływ, żyły będą jaskrawoczerwone, a krew w obu naczyniach szybko stanie się identyczna. Gałęzie powstające z żyły pępowinowej zwykle nakładają się na gałęzie z tętnicy pępowinowej na powierzchni łożyska.
- Gdy zarodek się ożywi, przykryj go (ale nie łożysko) wstępnie podgrzanym żelem USG, pamiętając o delikatnym usunięciu wszelkich pęcherzyków powietrza (za pomocą cienkich kleszczyków) z okolic zarodka. Uzupełnij naczynie podgrzanym PBS.
nuta: Zwracać uwagę na poziom roztworu w strzykawkach PBS i strzykawkach z żelem, a w razie potrzeby dodać zapasowe strzykawki do zlewki grzewczej.
- Zamontuj szklaną igłę na dużej kuli plasteliny na krawędzi naczynia do wycinki i włóż koniec igły do PBS. Wybierając żyłę na powierzchni kosmówki krążka łożyska, tak daleko od głównej gałęzi, jak to rozsądne, przytnij końcówkę do rozmiaru za pomocą nożyczek. Wstrzyknięcie jest najłatwiejsze, jeśli końcówka jest przycięta pod niewielkim kątem. Usuń wszelkie postrzępione krawędzie szkła za pomocą krawędzi nożyczek sprężynowych.
- Za pomocą pompy strzykawkowej powoli wstrzykiwać roztwór mikropęcherzyków w ilości 20 μl/min do szklanej igły, aż całe powietrze zostanie usunięte z końcówki igły i będzie można zauważyć, że mikropęcherzyki mogą swobodnie przepływać do PBS. Zatrzymać pompę i zresetować do objętości wtrysku 20 μl. Nie należy dopuścić do przedostania się powietrza do układu naczyniowego zarodka podczas wstrzyknięcia.
- Delikatnie wprowadzić szklaną końcówkę igły do jednej z żył w łożysku i upewnić się, że jest nieruchoma. Odchyl głowicę stereoskopu i umieść głowicę nad zarodkiem. Rozpocznij obrazowanie.