Izolacja bakterii komensalnych spojówek na podstawie wymazówki: technika izolacji bakterii komensalnych z spojówki modelu mysiego

Streszczenie

Źródło: Smith-Page, K. et al. Izolacja i identyfikacja spojówek komensalnych u myszy. J. Vis. Exp. (2021)

Ten film opisuje technikę opartą na wymazówce, aby izolować żywe bakterie komensalne ze spojówki oka. Technika ta może być wykorzystana do profilowania komensalnego mikrobiomu bakteryjnego spojówki, który odgrywa rolę obronną przed patogenami.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie wymazu z oka, ustawienie pola roboczego, pobieranie wymazu z oka myszy i wzbogacanie próbki

1. Przygotuj sterylne wymazy z oczu
   nuta: Sterylne waciki do oczu to cienko pokryte drewniane wykałaczki z cienką warstwą włókna bawełnianego i wykonane we własnym zakresie.
   1. W autoklawie należy użyć odpowiedniej ilości waty bawełnianej i wykałaczek dla liczby myszy do pobrania wymazu.
   2. Ściśnij półcentymetrowy kawałek bawełnianej pałki kciukiem i palcem wskazującym. Wyciągnij mrugnięcie, ciągnąc za krawędzie kciukami i palcami wskazującymi, aby utworzyć płaską, pojedynczą porowatą warstwę, zatrzymując się tuż przed rozpadnięciem się mrugnięcia (dopuszczalne są małe kawałki bawełny rozproszone po rozciągniętym mrugnięciu).
   3. Zakręć mrugnięciem wokół jednego z ostrych końców wykałaczki, lekko przytrzymując rozciągnięty kawałek na końcówce wykałaczki, gdy jest skręcony, patrz rysunek 1. "Gotowy" wacik do oczu będzie miał bardzo cienką warstwę bawełny rozciągniętą na końcówce, rozciągającą się około pół do jednego centymetra od końcówki.
   4. Włóż "gotowe" waciki do małej zlewki, wacikiem do dołu i przykryj. Autoklaw.
2. Konfigurowanie obszaru roboczego
   1. Przygotuj znieczulenie zawierające 2 ml ketaminy (100 mg/ml), 400 μl ksylazyny (100 mg/ml) i 27,6 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej (0,9% NaCl w dH₂O) w sterylnej sterylnej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Filtr, sterylizować i podawać znieczulenie do natychmiastowego użycia (może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc; przed użyciem zawsze pozostawić do zrównoważenia do temperatury pokojowej).
   2. Oczyść i wyczyść obszar roboczy środkiem dezynfekującym, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
   3. Porcję 0,5 ml sterylnego podłoża do infuzji mózgu i serca (BHI) rozłożyć na oznakowanych 1,5 ml sterylnych probówek do mikrowirówek (1 probówka na mysz i grupa kontrolna); umieścić na stojaku do mikrowirówek. Ustaw ruszt na lodzie.
   4. Ustaw przepływ pracy w następujący sposób (od lewej do prawej): stacja anestezjologiczna dla myszy (klatka zawierająca myszy eksperymentalne, pusta sterylna klatka, znieczulenie w temperaturze pokojowej, igła 25 G i strzykawka 1 ml), stacja wymazowa do oczu (podawane BHI na lodzie, sterylizowane wymazy z oczu, czyste ręczniki papierowe, spray 70% izopropanolu) i stacja galwaniczna (płytki agarowe z krwią o temperaturze pokojowej, pipeta 10 μL, 10 μL sterylne jednorazowe końcówki, pojemnik na odpady biologiczne).
3. Wymaz z oczu
   1. Każdej dorosłej myszy podać 10 μl znieczulenia na 1 g masy ciała myszy dawkę ketaminy i ksylazyny odpowiednio dootrzewnowo każdej dorosłej myszy i umieścić w autoklawowanej klatce. Przetestuj znieczulenie, ściskając poduszkę tylnej części stopy; Brak ruchu wskazuje na odpowiednie znieczulenie.
   2. Przypisz jedną rękę do obsługi tylko znieczulonych myszy, a drugą do obsługi tylko wymazu z oka i hodowli. W celu pobrania wymazu wyjmij w pełni znieczuloną mysz z klatki; Umieść na czystej powierzchni roboczej umieszczonej na boku z odsłoniętym lewym okiem. Spryskaj dłonie w rękawiczkach izopropanolem, osusz czystym ręcznikiem papierowym.
   3. Odkręć specjalnie oznakowaną probówkę wirówki mikrowirówki BHI za pomocą dedykowanej ręki do obsługi mediów. Umieść probówkę z powrotem w stojaku na mikrowirówkę na lodzie. Zanurz pokrytą bawełną końcówkę wacika do oczu w BHI, wyjmij wacik z probówki, obracając końcówkę 2 razy względem rurki wewnętrznej, aby usunąć nadmiar płynu.
   4. Ręką trzymającą mysz delikatnie chwyć mysz za kark. Drugą ręką przyłóż końcówkę wacika do oka na przyśrodkowym obszarze spojówki lewego oka, patrz rysunek 2A. Lekko wciśnij gałkę oczną i przesuń wacik ruchem mycia okien (rysunek 2B) w przód iw tył, między dolną powieką a okiem, 10 razy. Utrzymuj stałe ciśnienie.
   5. Nie dotykając futra, delikatnie zdejmij końcówkę wacika, prostopadle do miejsca, w którym została włożona, i umieść wacik bawełnianą stroną do dołu bezpośrednio w oznakowanej probówce mikrowirówkowej zawierającej pożywkę BHI. Nałóż nawilżające krople do oczu na pobrane oczko.
   6. Umieść mysz z powrotem w klatce.
   7. Pozostaw wacik na 10 do 15 minut na lodzie i usuń wymazówkę z oczu wysterylizowaną ręką w rękawiczce, mieszając końcówkę z podłożem przez 10 obrotów. Wyjmij wacik, obracając końcówkę o wewnętrzną ściankę probówki mikrowirówki przez 5 obrotów. Wyrzuć wacik do pojemnika na zagrożenie biologiczne.
   8. Powtórzyć kroki od 1.3.2 do 1.3.7 dla każdej myszy i dla próbek kontrolnych (wymaz ze skóry lub futra). Odpowiednio sterylizuj rękawiczki między każdym wacikiem.
4. wzbogacenie
   1. Wzbogacić próbkę przez statyczną inkubację probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C
   2. Podczas inkubacji oznacz jedną tryptykazę sojową o temperaturze pokojowej z 5% płytką agarową z krwią owczą (płytka TSA) na mysz i podziel na pół.
   3. Po inkubacji wymazu z oka należy wyjąć wzbogacone próbki z inkubatora i umieścić na lodzie.
   4. Krótko zawirować próbki, aby wymieszać je i pokryć płytką zgodnie ze schematem na rysunku 3A. Porcję 10 μl próbki nanieść na płytkę TSA i przechylić płytkę w celu utworzenia paska, powtórzyć 2 razy.
   5. Po drugiej stronie linii podziału płytki nanieś 10 μl próbki na agar, powtórz 9 razy.
   6. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 18 godzin, 2 dni i 4 dni (w czystej komorze, która zapobiega wysychaniu płytek agarowych). Policz kolonie w paskach, zanotuj morfologię i oblicz jednostki tworzące kolonie (CFU) na wymaz dla morfologicznie podobnych izolatów. Spójrz na kropki, aby znaleźć unikalne organizmy, które nie zostały uchwycone w paskach.

Wyniki

Rysunek 1: Wymaz z oczu wykonany w firmie.
(A) Cienki, około 1 cm, kawałek ciągniętej bawełnianej pałeczki trzymano między sterylnym czubkiem wykałaczki a palcem wskazującym, a wykałaczkę zwijano, utrzymując lekki nacisk na palec wskazujący, aż bawełna została całkowicie zwinięta na końcówkę wykałaczki. (B) Przykład wymazu z oka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Końcówka do pipetowania od 0,1 do 10 μl	USA Naukowe	Nr kat. 1110-300	Autoklaw przed użyciem
Pipeta Eppendorf o pojemności od 0,5 do 10 μl	Fisher Naukowy	13-690-026
Strzykawka 1 ml	Fisher Naukowy	BD309623	1 strzykawka na każdą grupę wymazów z oczu
Probówki Eppendorf 1,5 ml	USA Naukowe	1615-5500	Autoklaw przed użyciem
Końcówka do pipety 1000 μ ml	USA Naukowe	Lata 1111-2021	Autoklaw przed użyciem
200 do 1000 μl pipetara Gilsona (P1000)	Fisher Naukowy	F123602G
Igła 25 G	Fisher Naukowy	14-826AA	1 igła na grupę wymazów z oka
3 % nadtlenek wodoru	Fisher Naukowy	Numer katalogowy S25359
Inkubator 37 ° C	Sprzęt laboratoryjny
70 % Izopropanol	Fisher Naukowy	PX1840-4
Ana-Sed do wstrzykiwań (ksylazyna 100 mg/ml)	Zdrowie zwierząt w Santa Cruz	SC-362949Rx
Palnik Bunsena	Sprzęt laboratoryjny
Czyste ręczniki papierowe	Sprzęt laboratoryjny
Bawełniane matowanie/sterylna bawełna zwijana	CVS (Życiorys)
Ketamina (100 mg/ml)	Henryk Schein	9950001
Myszy	Laboratoria Jacksona	Zobacz materiał C57/BL6J
Szalki Petriego	Fisher Naukowy	08-757-12	Do płytek agarowych z solą mannitol
Pożywki infuzyjne do mózgu i serca RPI	Fisher Naukowy	50-488525	Przygotuj zgodnie ze wskazówkami i autoklaw
SteriFlip (sulfon poliestrowy 0,22 μm)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	Do sterylizacji znieczulenia
Sterylna klatka dla myszy	Sprzęt laboratoryjny
Wykałaczki (okrągłe bambusowe)	Niezbędnik kuchenny		Autoklaw przed użyciem i przygotowanie wymazu
Tryptykaza Agar sojowy II z 5% płytkami krwi owczej	Fisher Naukowy	4321261	Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia
Jednorazowe krople do oczu	CVS Apteka		Nawilżające krople do oczu Bausch and Lomb Soothe, 28 fiolek, 0.02 uncji każda