Stymulacja skrawków mózgu z wykorzystaniem sieci mikrofluidycznej i standardowej komory perfuzyjnej

Podsumowanie

Prezentujemy sposób wykonania prostego urządzenia mikroprzepływowego, które można zintegrować ze standardowymi zestawami do elektrofizjologii, aby w kontrolowany sposób eksponować mikroskalowe powierzchnie skrawka mózgu na działanie różnych neuroprzekaźników.

Streszczenie

Wykazaliśmy możliwość wykonania dwupoziomowego urządzenia mikrofluidycznego, które można łatwo zintegrować z istniejącymi układami do elektrofizjologii. Dwupoziomowe urządzenie mikrofluidyczne jest wytwarzane przy użyciu standardowego dwuetapowego procesu litografii z wykorzystaniem rezystu negatywowego ¹. Pierwszy poziom zawiera mikrokanały z portami wlotowymi i wylotowymi na obu końcach. Drugi poziom zawiera mikroskalowe otwory okrągłe, rozmieszczone w połowie długości kanału i wycentrowane względem jego szerokości. Do pompowania płynów z portu wlotowego do portu wylotowego stosowana jest metoda pompowania pasywnego ². Urządzenie mikrofluidyczne jest zintegrowane z gotowymi komorami perfuzyjnymi, co pozwala na bezproblemowe połączenie z układem elektrofizjologicznym. Płyny wprowadzone przez porty wlotowe przepływają przez mikrokanały w kierunku portów wylotowych, a także wydostają się przez okrągłe otwory znajdujące się nad mikrokanałami do kąpieli perfuzyjnej. W ten sposób dolna powierzchnia skrawka mózgu umieszczonego w kąpieli komory perfuzyjnej nad urządzeniem mikrofluidycznym może być eksponowana na działanie różnych neurotransmiterów. Mikroskalowa grubość urządzenia mikrofluidycznego oraz transparentność materiałów [szklana lamella i PDMS (polydimethylsiloxane)] użytych do jego wykonania umożliwiają mikroskopię skrawka mózgu. Urządzenie mikrofluidyczne pozwala na modulację (zarówno przestrzenną, jak i czasową) bodźców chemicznych wprowadzanych do mikrośrodowiska skrawka mózgu.

Protokół

Wytwarzanie formy z SU-8

Przygotowanie roztworu wzorcowego

1. Matryca SU-8 na podłożu z wafla krzemowego jest przygotowywana przy użyciu standardowego dwuetapowego procesu litografii z wykorzystaniem rezystu negatywowego.
2. Znaki wyrównawcze na waflu krzemowym są usuwane za pomocą żyletki, ponieważ wysokość tych struktur (znajdujących się wzdłuż zewnętrznej krawędzi wafla) jest większa niż wysokość rzeczywistych struktur urządzenia.
3. Wafer krzemowy jest następnie czyszczony izopropanolem i suszony w strumieniu N₂. Filary wspierające wykonane z taśmy o grubości mniejszej niż najwyższa struktura urządzenia zastępują znaki wyrównawcze po czterech stronach wafla.
   
   Uwaga: Jeśli wysokość filarów wspierających jest większa niż najwyższe struktury urządzenia, otwory przelotowe nie zostaną utworzone w formie z PDMS.
   
   
4. Matryca z wafla krzemowego zostaje umieszczona na płycie grzejnej w temperaturze pokojowej.

Przygotowanie roztworu PDMS

1. Cztery gramy roztworu polidimetylosiloksanu (PDMS) przygotowuje się poprzez dokładne wymieszanie 10 części elastomeru silikonowego z 1 częścią utwardzacza.
   
   Uwaga: Należy upewnić się, że oba roztwory zostały wymieszane jednorodnie, aby uzyskać zbliżone właściwości fizyczne w całej formie z PDMS.
   
   
2. Pęcherzyki powietrza powstałe w roztworze PDMS podczas procesu mieszania usuwa się za pomocą desykatora próżniowego.

Powlekanie i utwardzanie PDMS

1. Pozbawiony pęcherzyków powietrza roztwór PDMS jest powoli dozowany na matrycę SU-8, dbając o to, aby podczas procesu dozowania nie powstały pęcherzyki.
2. Jeden koniec folii przezroczystej do pisania jest następnie kładziony na płycie grzewczej i powoli opuszczany na roztwór PDMS, aby równomiernie rozprowadzić PDMS na matrycy SU-8. Wszelkie pęcherzyki powstałe podczas tego procesu należy usunąć za pomocą sondy.
   
   [Uwaga: Nie należy podnosić folii, aby zapobiec powstawaniu kolejnych pęcherzyków.]
   
   
3. Na arkuszu folii kładzie się płytkę borofloat, aby zastosować jednolity nacisk. Delikatnie naciska się górną powierzchnię najwyższych struktur okrągłych (znajdujących się w połowie długości kanałów i wycentrowanych wzdłuż ich szerokości) w taki sposób, aby między folią a powierzchnią SU-8 struktur okrągłych znajdowała się minimalna ilość PDMS lub nie było go wcale.
4. Trzy kolejne płytki borofloat są kładzione na zestaw składający się z wafla krzemowego i płytki borofloat, aby zastosować stały nacisk na górną powierzchnię struktur z okrągłymi otworami przed i w trakcie procesu sieciowania.
5. Temperaturę płyty grzewczej zwiększa się następnie do 75°C i PDMS jest sieciowany w tej temperaturze przez 1 godzinę. Następnie temperaturę płyty grzewczej obniża się do 50°C.
6. Płytki są usuwane, a folię przezroczystą ostrożnie zdejmuje się, pozostawiając matrycę oraz pokrywającą ją cienką warstwę PDMS.

Konstrukcja urządzenia mikrofluidycznego

Usuwanie arkusza PDMS z matrycy

1. Zewnętrzna granica komory perfuzyjnej zostaje wycięta w arkuszu PDMS za pomocą żyletki, po uprzednim dopasowaniu portów komory perfuzyjnej do portów na matrycy SU-8.
2. Następnie arkusz PDMS jest ostrożnie oddzielany od matrycy, poprzez odciąganie wzdłuż kanałów, aby zapobiec rozdarciu PDMS. Arkusz PDMS zostaje umieszczony na folii przezroczystej powierzchnią sieci mikrofluidycznej skierowaną do góry.
3. Następnie za pomocą wycinaka do korków wykonuje się porty wlotowe i wylotowe.

Przyklejanie arkusza PDMS do szkiełka przedmiotowego

1. Powierzchnię wiązania arkusza PDMS (powierzchnię zawierającą sieć mikroprzepływową) oraz szklaną lamelkę należy delikatnie oczyścić za pomocą taśmy klejącej 3M, położyć na folii przezroczystej, a następnie umieścić w komorze z plazmą O₂.
2. Powierzchnie wiązania poddaje się działaniu plazmy o mocy 165 W przez 10 s. Powierzchnię szklanej lamelki potraktowaną plazmą należy niezwłocznie połączyć z powierzchnią arkusza PDMS potraktowaną plazmą.
   
   Uwaga: Należy lekko docisnąć powierzchnię szkła, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione między powierzchniami wiązania.
   
   
3. Należy odczekać 5 minut, aby uzyskać trwałe połączenie między PDMS a szkłem. Po upływie 5 minut należy delikatnie usunąć folię przezroczystą, na której umieszczono arkusz PDMS w procesie wiązania.
4. Urządzenie mikroprzepływowe umieszcza się w systemie plazmy tlenowej, aby uczynić kanały hydrofilowymi. Obróbka plazmowa jest przeprowadzana przy mocy 165 W przez 1 minutę.

Integracja urządzenia mikrofluidycznego z komorą perfuzyjną

Przygotowanie komory perfuzyjnej

1. Zamówiono gotową komorę perfuzyjną, a następnie nawiercono otwory wlotowe i wylotowe w taki sposób, aby po połączeniu urządzenia mikroprzepływowego z komorą porty obu elementów były ze sobą zrównane. Dolną powierzchnię komory perfuzyjnej powleczono PDMS w celu uzyskania szczelnego połączenia między komorą a urządzeniem mikroprzepływowym.
2. Arkusz folii przezroczystej do pisania naniesiono na płytkę grzejną w temperaturze pokojowej.
3. Przygotowano jeden gram roztworu PDMS w procesie analogicznym do opisanego wcześniej. Roztwór PDMS pozbawiony pęcherzyków powietrza powoli naniesiono na arkusz folii, unikając tworzenia pęcherzyków.
4. Na roztwór PDMS położono komorę perfuzyjną.
5. Na wierzchu komory umieszczono płytkę z borofloat, aby przyłożyć równomierny nacisk i uzyskać cienką warstwę PDMS na dolnej powierzchni komory.
6. Następnie zwiększono temperaturę płytki grzejnej do 75°C i utwardzano PDMS w tej temperaturze przez 1 godzinę.

Łączenie urządzenia mikroprzepływowego i komory perfuzyjnej

1. Płytę usuwa się, a następnie delikatnie zdejmuje folię transparentną, pozostawiając komorę perfuzyjną oraz cienką warstwę PDMS pokrywającą jej dolną powierzchnię. Nadmiar PDMS usuwa się za pomocą żyletki, a z portów dostępowych przy użyciu ostrej sondy.
2. Powierzchnia PDMS urządzenia mikroprzepływowego oraz dolna powierzchnia PDMS komory są następnie delikatnie oczyszczane za pomocą taśmy 3M, kładzione na arkusz folii transparentnej, a na koniec umieszczane w komorze plazmy tlenowej.
3. Powierzchnie poddaje się działaniu plazmy o mocy 165 W przez 10 s. Powierzchnia komory pokryta PDMS jest niezwłocznie łączona z powierzchnią PDMS urządzenia mikroprzepływowego.
   
   Uwaga: Należy delikatnie nacisnąć powierzchnię szklaną, aby usunąć pęcherzyki powietrza uwięzione między łączonymi powierzchniami.
   
   
4. Bezpośrednio przed użyciem urządzenie umieszcza się w systemie plazmy tlenowej, aby uczynić kanały hydrofilowymi. Traktowanie plazmą wykonuje się przy mocy 165 W przez 1 minutę.

Ekspozycja przekrojów mózgu na mikrośrodowisko neurochemiczne przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego

1. Hydrofilowe mikrokanały zestawu (microfluidic device)-(perfusion chamber) wypełnia się standardowym roztworem ACSF (sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego).
2. W portach wlotowych nanosi się małe krople roztworu ACSF, pozwalając na wciągnięcie płynu do kanałów. Wszelkie pozostałe pęcherzyki powietrza usuwa się za pomocą strzykawki z portu wylotowego. W porcie wylotowym nanosi się dużą kroplę roztworu ACSF, aby umożliwić pasywne pompowanie płynów z portów wlotowych do wylotowych urządzenia mikroprzepływowego.
   
   Uwaga: Należy zadbać o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza z kanałów, aby umożliwić przepływ płynów metodą pasywnego pompowania.
   
   
3. Zestaw (microfluidic device)-(perfusion chamber) mocuje się na płaskiej platformie, a platformę mocuje się w adapterze mikroskopu.
4. Standardowe przewody wlotowe i wylotowe (ssące) podłącza się do komory perfuzyjnej w celu ciągłej perfuzji skrawka mózgu standardowym roztworem ACSF. Roztwór ACSF jest stale napowietrzany mieszanką 95% O2-5% CO₂.
   
   Uwaga: Należy dostosować położenie przewodu ssącego, aby utrzymać stały poziom ACSF w kąpieli komory perfuzyjnej.
   
   
5. Po wypełnieniu komory perfuzyjnej roztworem ACSF, za pomocą zakraplacza umieszcza się w niej skrawka mózgu. Używając sondy, pozycjonuje się skrawek mózgu nad okrągłymi otworami w urządzeniu mikroprzepływowym. Gdy skrawek mózgu znajdzie się w pożądanej pozycji nad otworami, należy go unieruchomić za pomocą kotwicy do skrawków.
6. Urządzenie mikroprzepływowe może teraz zostać użyte do poddawania skrawków mózgu (umieszczonych w komorze perfuzyjnej na górze sieci mikroprzepływowej) działaniu różnych neuroprzekaźników poprzez pasywne pompowanie płynów.

Dyskusja

Istniejące komory do perfuzji skrawków mózgu w skali makro i mikro są ograniczone pod względem rozdzielczości przestrzennej podczas podawania neuroprzekaźników na skrawki mózgu. Przedstawiona tutaj technologia urządzeń mikroprzepływowych pozwala pokonać to ograniczenie dzięki zastosowaniu prostych technik bioMEMS. Przewiduje się, że prostota wykonania urządzenia mikroprzepływowego oraz łatwość jego integracji z istniejącymi zestawami do elektrofizjologii umożliwią szerokie zastosowanie zaprezentowanej technologii. Dzięki...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
RC-26GPL	Narzędzie	Warner Instruments	W2-64-0236	Komora rejestracyjna RC-26GLP z niskim profilem i dużą kąpielą
SHD-26GH/10	Narzędzie	Warner Instruments	W2-64-0253	Stalowy przycisk do skrawków dla RC-26G, odstęp między gwintami 1,0 mm
PDMS (polidimetylosiloksan)	Odczynnik	Dow Corning	Sylgard 184	Zestaw do elastomeru silikonowego
Plasma Preen-II 862	Narzędzie	Plasmatic Systems, Inc.		Mikrofalowy system plazmowy
Model P-1	Narzędzie	Warner Instruments	W2-64-0277	Zwykła platforma z serii 20, Model P-1
SA-NIK	Narzędzie	Warner Instruments	W2-64-0291	Adapter dla Nikon Diaphot/TE200/TE2000, SA-NIK
Natleniony, podgrzany ACSF (sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy)	Odczynnik			Dokładny skład będzie się różnić w zależności od zastosowania