Wsteczna perfuzja serca Langendorffa: technika ex vivo perfuzji izolowanego serca myszy

Streszczenie

Źródło: Wu, K. et al. Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie wykonujemy retrogradacyjną perfuzję Langendorffa izolowanego serca myszy. Podczas zabiegu czynność serca jest utrzymywana poprzez jego wsteczne perfuzję roztworem perfuzyjnym przez tętnice wieńcowe za pomocą kaniuli wprowadzanej do aorty wstępującej. Model służy do badania patofizjologii serca serca.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie roztworu i aparatu perfuzyjnego

1. Zmontuj aparat Langendorffa o stałym przepływie (dostępny na rynku lub własnej produkcji). Rysunek 1 przedstawia prosty schemat.
2. Przygotować roztwory zgodnie z odczynnikami podanymi w Tabeli 1 i Tabeli 2.
3. Włącz łaźnię z krążącą wodą i wyreguluj odpowiednią temperaturę wejściową (42,7 °C w naszym laboratorium), aby upewnić się, że odpływ systemu cyrkulacji perfuzyjnej z kaniuli osiągnie 37 °C.
4. Oczyść system perfuzyjny, cyrkulując wodę dejonizowaną. Jeśli wymagany jest stan sterylny, przepuść 75% etanolu przez system perfuzyjny przez 15 minut, a następnie wodę dejonizowaną (co najmniej 10 cykli, aby uniknąć wpływu toksyczności alkoholu na serce).
5. Zmierz czas i objętość dla jednego cyklu systemu cyrkulacji perfuzacji, aby określić, ile mililitrów natlenionego roztworu Tyrode'a należy załadować w następnym kroku perfuzji.
6. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w żądany sposób.
7. Ustawić natężenie przepływu systemu perfuzyjnego na 4 ml/min.
8. Przygotuj dwie czyste szalki Petriego o średnicy 35 mm – jedna zawierająca roztwór Tyrode'a (szalka Petriego 1), druga zawierająca roztwór 1 (szalka Petriego 2).
9. Przygotować strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną roztworem 1 i stalową igłą kaniulową o sile 20 G z wycięciem w miejscu, w którym odległość wynosi 1 mm od końcówki. Przygotuj luźny węzeł z szwem 3-0 do trzonu kaniuli. Wyreguluj pole widzenia mikroskopu stereoskopowego i upewnij się, że końcówka kaniuli znajduje się poniżej powierzchni cieczy szalki Petriego 2.

2. Przygotowanie zwierząt

1. Podawać heparynę (stężenie 1,000 j.m./ml; 0,2 ml/mysz) dootrzewnowo myszom, aby uniknąć zakrzepów krwi. Po 10 minutach znieczulij myszy pentobarbitalem sodu (50 mg / kg, wstrzyknięcie dożylne) i upewnij się, że myszy przestaną reagować na szczypanie ogona/palca. Zwichnięcie szyjki macicy należy wykonać 20 minut po podaniu heparyny.
2. Przenieś myszy na platformę chirurgiczną, unieruchom myszy w pozycji leżącej, wysterylizuj klatkę piersiową 75% etanolem i osusz ją gazą lub serwetką.

3. Wycięcie serca i kaniulacja aorty

1. Podnieś skórę mieczykowatej za pomocą kleszczy tkankowych i wykonaj niewielkie boczne nacięcie przez skórę nożyczkami do tkanek. Wykonaj rozwarstwienie między skórą a powięzią i rozszerz nacięcie skóry w kształcie litery V w kierunku pach po obu stronach.
   1. Kontynuuj ten sam ślad nacięcia przez klatkę piersiową, a następnie odchyl klatkę piersiową w górę, zaciskając mostek kleszczami tkankowymi, aby całkowicie odsłonić serce i płuca.
2. Oderwij osierdzie za pomocą zakrzywionych kleszczy. Rozerwij grasicę w obie strony za pomocą dwóch zakrzywionych kleszczy, jeśli zakrywa duże naczynia. Delikatnie pociągnij podstawę serca w kierunku ogona za pomocą zakrzywionych kleszczy, aż zobaczysz naczynie krwionośne w kształcie litery "Y" (aortę i jej tętnice rozgałęzione).
3. Aby zarezerwować różne długości aorty do kaniulacji i porównania, należy przeciąć aortę na lewej tętnicy szyjnej wspólnej (zielona linia na rycinie 2) i przeciąć tętnicę ramienno-głowową w tym samym czasie u niektórych myszy. Transekt na aorcie wstępującej u innych myszy (linia na rysunku 2).
   nuta: Dla tych, którzy są nowicjuszami w tej procedurze, ten krok można również wykonać pod mikroskopem stereoskopowym.
4. Wyciąć serce i natychmiast zanurzyć w szalce Petriego 1, aby umyć i wypompować pozostałą krew.
5. Przenieś serce na szalkę Petriego 2 i w razie potrzeby przytnij nadmiar tkanki za pomocą cienkich nożyczek do tęczówki. Dla tych, którzy są nowicjuszami w tej procedurze, wykonaj ten krok pod mikroskopem stereoskopowym, aby uniknąć błędnego przecięcia aorty lub innych struktur serca.
6. Wcisnąć strzykawkę, aby usunąć pęcherzyki powietrza przed kaniulacją aorty. Wykonaj kaniulację aorty wstecznej za pomocą dwóch prostych kleszczy wiążących (gładkich szczęk) pod mikroskopem stereoskopowym. Upewnij się, że cały proces kaniulacji znajduje się pod powierzchnią cieczy.
7. Unikaj penetracji zastawek aortalnych i dostosuj głębokość odpowiednio do aorty wstępującej (myszy, przez którą aorta została przecięta w lewej tętnicy szyjnej wspólnej) i korzenia aorty (myszy, u której aorta została przecięta przez aortę wstępującą).
   nuta: Głębokość kaniulacji aorty (określana po prostu jako głębokość) jest tutaj definiowana jako pozycja, w której końcówka kaniuli znajduje się w aorcie lub w której aorta jest podwiązana.
8. Podwiązać aortę za pomocą szwu 3-0 przed węzłem do wcięcia kaniuli. Delikatnie docisnąć zawartość strzykawki, aby wypłukać resztki krwi.
   nuta: Krew opuści tętnice wieńcowe i wypłynie z żył grzbietowych, jeśli głębokość zostanie prawidłowo ustawiona. Serce i przydatki przedsionkowe rozszerzą się i staną się blade.
9. Wyjmij i podłącz kaniulę do aparatu Langendorffa. Jeszcze raz należy uważać, aby pęcherzyki powietrza nie dostały się do serca.
   nuta: Należy pamiętać, że czas od torakotomii do początkowej perfuzji nie powinien przekraczać 5 minut.
10. W przypadku perfuzji serca najpierw należy zalać i perfluksować roztwór Tyrode'a przez około 10 s (objętość płynu biegnąca przez 10 s w systemie używanym w tym protokole wynosi około 0,7 ml), jeśli w przedsionkach znajduje się resztkowa krew, a następnie przejść do roztworu 1. Jednak wystarczy wykonać perfuzję z roztworem 1, jeśli w przedsionkach nie ma resztkowej krwi. Płucz serce przez około 2 minuty.

Tabela 1. Rozwiązania do izolacji CM dorosłych myszy.

rozwiązanie	Zawartość (stężenie końcowe w mmol/l, jeśli nie określono inaczej)	Zauważyć
Roztwór perfuzyjny (roztwór 1)	113 NaCl, 4,7 KCl, 0,6 KH2PO4, 0,6 Na2HPO4, 1,2 MgSO4, 12 NaHCO3, 10 KHCO3, 10 HEPES, 15 Tauryna, 5 Glukoza, 10 2,3-butanodion monoksym(BDM)	Który może być przechowywany przez 3 dni w temperaturze 4 °C. Glukoza, tauryna i BDM są dodawane w dniu eksperymentu. Przygotuj 200 ml roztworu perfuzyjnego dla każdego serca.
Rozwiązanie Tyrode'a (rozwiązanie 2)	140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 1 CaCl2, 5 Glukoza	Który może być przechowywany przez 3 dni w temperaturze 4 °C. CaCl2 i glukozę dodaje się w dniu eksperymentu, dostosuj pH do 7,3-7,4 z nasyconym NaOH w temperaturze pokojowej (28-30°C) za pomocą miernika pH.

Tabela 2. Rozwiązania do izolacji i przechowywania CM dorosłych myszy.

rozwiązanie	treść	Zauważyć
Roztwór wytrawiający (roztwór 3)	25 ml roztworu 1, 6 μL 100 mM/L CaCl2, 25 mg kolagenazy II, 50 μl (2,5 % 10×) trypsyny	Za każde serce
Zatrzymaj rozwiązanie 1 (rozwiązanie 4)	9 ml roztworu 1, 1 ml FBS (płodowa surowica bydlęca), 4 μl 100 mM/L CaCl2	Za każde serce
Zatrzymaj rozwiązanie 2 (rozwiązanie 5)	9,5 ml roztwór 1, 0,5 ml FBS (płodowa surowica bydlęca), 4 μl 100 mM/L CaCl2	Za każde serce
Roztwór do ponownego zawieszania komórek (roztwór 6)	13 ml roztwór 1,7μL 1M/L CaCl2, BSA (Bull Serum Albumin) w dawce, która może tworzyć cienką warstwę pokrywającą powierzchnię cieczy	Za każde serce

Wyniki

Rysunek 1. Schemat ideowy zmontowanego zmodyfikowanego systemu Langendorffa.System ten jest ekonomiczny i przenośny dla użytkowników. Składa się z dwóch części rurki z tworzywa sztucznego - jednej do wody (średnica wewnętrzna, 8 mm) i jednej do perfuzatu (średnica wewnętrzna, 1,5 mm) - z których dystalny koniec jest podłączony do medycznego trzydrogowego kranu PE z zamkiem Luer. Szkl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Monoksym 2,3-butanodionu (BDM)	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 31550
CaCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C4901
glukoza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G7528
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375
Kcl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9333
KH2PO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P5655
KHCO3	Sigma-Aldrich	237205
MgCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M8266
MgSO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M7506
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7907
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S5761
Pompa perystaltyczna	Dłuższa pompa	Zobacz materiał BT100-2J
tauryna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T0625
Kąpiel wodna	JULABO	ED (wersja 2)

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: