Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie do izolacji komórek zaworowych od dorosłych myszy
- Oczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne pokazane na rysunku 1A, używając 70% v/v etanolu, a następnie sterylizując je w autoklawie przez 30 minut. Wyczyść miejsce pracy chirurgicznej 70% etanolem.
- Dodać 500 μl penicyliny-streptomycyny do 50 ml 10 mm HEPES. Przygotować porcję 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Utrzymuj roztwory na lodzie.
- Przygotuj roztwory kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml i 4,5 mg/ml i użyj 5 ml każdego roztworu w probówkach o pojemności 15 ml do wykonania całej procedury. Aby przygotować 5 ml kolagenazy 1 mg/ml, zmieszaj 5 mg kolagenazy z 2,5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM, wolna od płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i 2,5 ml 10 ml 10 mM HEPES uzupełnionych antybiotykami (1% penicylina-streptomycyna z kroku 1.2). Przefiltruj roztwory przez filtr 0,22 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
nuta: Roztwory należy przechowywać na lodzie, aby chronić enzymy.
- Przed użyciem podgrzać roztwór DMEM do temperatury 37 °C, wykonując wszystkie czynności opisane poniżej. Przygotować kompletną pożywkę, uzupełniając DMEM 1% penicyliny-streptomycyny, 1% pirogronianu sodu, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 1 ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy (patrz tabela materiałów) i 10% FBS.
2. Izolacja komórek zaworu
- Aby uzyskać 106 komórek do eksperymentu, użyj pięciu 8-tygodniowych myszy (minimum trzy). Umieść mysz w komorze indukcyjnej wraz z małym kawałkiem bibuły nasączonej 1 ml izofluranu, ale nie dopuszczaj do kontaktu z tkanką. Aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone; Sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp, a następnie poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Stosować izofluran w celu złagodzenia bólu przed zwichnięciem szyjki macicy, ponieważ procedura opisana poniżej jest nieuleczalna.
- Umieść mysz na platformie preparacyjnej i przymocuj łapy kaniulami, aby utrzymać ją na miejscu. Oczyść klatkę piersiową i brzuch etanolem; Otwórz brzuch i klatkę piersiową nożyczkami. Małymi nożyczkami chirurgicznymi przeciąć między lewym przedsionkiem a lewą komorą, aby wykrwawić mysz. Perfuzję serca za pomocą 10 ml zimnego 1x PBS, aby usunąć krew z serca.
- Przeciąć serce i zachować 3 mm od aorty wstępującej, jak pokazano na rysunku 1B. Wypreparuj zastawkę aortalną pod mikroskopem stereoskopowym. Przeciąć serce poziomo na środku komór (ryc. 1C). Przeciąć lewą komorę w kierunku aorty i ostrożnie wypreparować zastawkę aortalną (ryc. 1D-F). Umieść zawory razem w małym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.
- Umyj izolowane zawory w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 75 mm z 5 ml zimnego HEPES (10 mM) uzupełnionego antybiotykami (1% penicylina-streptomycyna) w celu usunięcia krwi (ryc. 2). Przygotuj dwie probówki kolagenazy o pojemności 15 ml w dawce 1 mg/ml i 4,5 mg/ml zgodnie z opisem w kroku 1.3 powyżej.
nuta: Po rozbiorze manipuluj izolowanymi zaworami w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
- Inkubować zastawki w kolagenazie typu I (1 mg/ml) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, ciągle wstrząsając (ryc. 2). Odwirować probówkę przez 5 minut przy 150 × g, przemyć osad raz 2 ml HEPES (10 mM) i wirować przez 30 s z dużą prędkością. Wlej zawartość tej probówki do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm i ostrożnie przenieś fragmenty tkanki za pomocą cienkiej pęsety do nowej probówki.
nuta: Na tym etapie VIC nadal nie są oddzielone od tkanki, a osad zawiera kawałki tkanki. Aby uniknąć zanieczyszczenia komórkami śródbłonka, nie należy odwirowywać po wirowaniu w kroku 2.5.
- Inkubować osad w probówce o pojemności 15 ml z 5 ml kolagenazy typu I (4,5 mg/ml) w temperaturze 37 °C w ciągłym mieszaniu przez 35 minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml w celu rozdzielenia komórek i odwirować przy 150 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
- Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml kompletnego DMEM. Wirować przy 150 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, aby oczyścić komórki.
nuta: Osad nadal będzie zawierał fragmenty tkanek.
- Ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki i umieścić komórki w jednym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w minimalnej ilości pożywki, aby ułatwić ich przyłączenie do szalki hodowlanej. Pozostaw komórki w spokoju w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla.
- Po 3 dniach sprawdź komórki pod mikroskopem, aby zweryfikować dobry wzrost w pobliżu resztek tkanki. Gdy 1,000 komórek będzie widocznych pod mikroskopem, ostrożnie usuń resztki tkanki za pomocą autoklawowanej pęsety i zmień pożywkę.
nuta: Płyta nie powinna być naruszona; Jeśli wymagana liczba komórek nie zostanie zaobserwowana, umieść naczynie do hodowli komórkowych z powrotem w inkubatorze na kolejne 2 dni.
