$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Zwierzęta
- Dorosłe samice myszy w wieku od 3 do 6 tygodni należy utrzymywać w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (z fazami 12L:12D i karmione ad libitum).
- Wstrzyknąć myszom dootrzewnowo 2,5 j.m. gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) w celu stymulowania wzrostu pęcherzyków poprzez naśladowanie działania hormonu folikulotropowego (FSH). Wyizoluj jajniki do pobrania antralnych oocytów 48 godzin później. Poddaj eutanazji samicę myszy, której wcześniej wstrzyknięto PMSG, zgodnie ze standardowymi wytycznymi.
- Szybko usunąć jajniki z jamy ciała i umieścić je na szalce Petriego zawierającej pożywkę M2 w celu późniejszej izolacji oocytów (patrz punkt 3).
- Wykonaj nacięcie na skórze pokrywającej ścianę brzucha, a następnie nacięcie w otrzewnej za pomocą sterylnych nożyczek preparacyjnych. Otwórz nacięcie, aby odsłonić brzuch, przesuń wnętrzności na jedną stronę za pomocą sterylnej pęsety i zlokalizuj jajowody, tworząc kształt litery V, zaczynając od pęcherza.
- Obserwuj jajniki znajdujące się poniżej nerek. Przytrzymaj każdą rurkę sterylną pęsetą i wykonaj małe nacięcie na dnie jajników, aby je uwolnić. Przenieść oba jajniki na dno szalki Petriego zawierającej wstępnie zrównoważoną pożywkę.
2. Przygotowanie hormonu
- Rozcieńczyć PMSG (dostępny w różnych stężeniach podstawowych) sterylnym izotonicznym roztworem soli fizjologicznej, aby uzyskać stężenie robocze 2,5 j.m. hormonu na 0,1 ml dla odpowiedniej objętości wstrzyknięcia.
nuta: Roztwory hormonów muszą być podane w probówkach o pojemności 0,5 ml i przechowywane w temperaturze -20 °C do dnia użycia. Nie przechowywać rozcieńczonych podwielokrotności dłużej niż trzy miesiące w temperaturze -20 °C. Po rozmrożeniu, jeśli wykonywane są seryjne wstrzyknięcia, porcje roztworów hormonów należy przechowywać w temperaturze +4 °C i zużyć je w ciągu 4 dni.
3. Izolacja oocytów antralnych
Dla prawidłowej izolacji oocytów:
- Zrównoważyć pożywkę M2 (M2) przy 5% CO2 i temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem procedury izolacji oocytów. Przygotuj dwie szalki Petriego (35 mm x 10 mm), jedną z 1 ml M2 do nakłucia jajników, a drugą z małymi kroplami (20 μl) M2 pokrytymi olejem mineralnym (~1,5 ml) do transferu oocytów po izolacji z jajnika (patrz kroki 3.4–3.6). Obie szalki Petriego należy przechowywać w inkubatorze w temperaturze 5% CO2 i temperaturze 37 °C do momentu, gdy będą gotowe do użycia.
- Podczas zabiegów izolacji oocytów należy używać mikroskopu stereoskopowego.
- Przygotuj cienkie szklane pipety do ust w celu pobrania oocytów, rozciągając szklane pipety Pasteura trzymane poziomo (trzymając końce pipety obiema rękami), nad pionowym płomieniem pochodzącym z palnika Bunsena (ryc. 1).
- Gdy szkło zacznie się topić, wyjmij pipetę z płomienia i wykonaj szybki ruch ciągnący, aby uzyskać żądaną pipetę. Mocno odetnij nadmiar szkła w pobliżu wąskiego punktu pipety paznokciami, aby wyregulować długość i średnicę wewnętrznej kapilary. Upewnij się, że cienka kapila ma średnicę wewnętrzną ~100 μm, nieco większą niż średnica oocytu (~80 μm).
- Aby dodać pipetę do ust, podłącz jeden koniec rurki aspiratora do wyciągniętej pipety za pomocą odpowiedniej końcówki, a drugi koniec umieść w jamie ustnej, zabezpieczając go zębami.
- Zebrać jajniki za pomocą sterylnej pęsety i umieścić je na dnie szalki Petriego do hodowli komórkowej (35 mm x 10 mm). Przykryj je 1 ml M2 uprzednio zrównoważonego w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (rysunek 2).
- Delikatnie nakłuć pęcherzyki antralne jajników sterylną igłą strzykawki insulinowej, aby uwolnić antralne oocyty w M2 (ryc. 3).
- Delikatnie przetrzeć oocyty przez wąską pipetę Pasteura w celu usunięcia komórek pęcherzykowych i wszelkich innych możliwych resztek tkanki (ryc. 4A), a następnie umieścić je na dnie małych kropelek (20 μl) M2 pokrytych olejem mineralnym odpowiednim do hodowli zarodków (wcześniej przygotowanym; Rysunek 4B).
nuta: Ważne jest, aby usunąć wszystkie komórki wzgórka przyczepione do osłonki przejrzystej oocytów poprzez ciągłe pipetowanie przez kilka różnych kropli M2. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zmian pH pożywki.
