$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Podwójne wtryski żywicy
- preparat
- Przygotuj roztwór żywicy. W przypadku podwójnych iniekcji żywicy należy przygotować zarówno żółtą, jak i zieloną żywicę, jak opisano w krokach 1.1.2-1.1.4.
- Przygotuj 1 ml porcji rozcieńczonej żywicy na mysz.
- Żółta żywica: Rozcieńczyć żółtą gumę silikonową (wysoka nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich) przezroczystym rozcieńczalnikiem w rozcieńczeniu 3:1, aby przygotować żółtą żywicę do wstrzykiwań.
- Zielona żywica: Wymieszaj niebieską gumę silikonową (niewykrywalna nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich) z przezroczystym rozcieńczalnikiem w rozcieńczeniu 1:1, aby uzyskać niebieską żywicę. Aby wytworzyć zieloną żywicę, wymieszaj rozcieńczoną niebieską żywicę z rozcieńczoną żółtą żywicą w stosunku 1:1. Dokładnie wymieszaj zieloną żywicę, aż kolor będzie jednorodny.
nuta: Niebieska żywica ma bardzo niską nieprzepuszczalność dla promieni rentgenowskich, która nie jest wykrywalna za pomocą mikrotomografii komputerowej, co wymaga rozcieńczenia żółtą żywicą w celu wytworzenia dwóch żywic o różnej nieprzepuszczalności dla promieni rentgenowskich.
ostrożność: Żywica może zawierać chromian ołowiu, który jest czynnikiem rakotwórczym. Wytwarza trujące gazy w ogniu. Z żywicą należy obchodzić się ostrożnie i należy ją wyrzucać jako odpady niebezpieczne.
- Przygotować dwa zestawy do wstrzykiwań (zestaw do wstrzykiwań #1 i zestaw do wstrzykiwań #2) z rurką zgodnie z opisem w punktach 1.1.6-1.1.11.
nuta: W przypadku dorosłych myszy (>P30 (30. dzień po urodzeniu) = P30 - 2 lata) należy użyć zestawu do wstrzykiwań #1 (rurka PE10 o średnicy zewnętrznej 0,6 mm) do iniekcji do wspólnego przewodu żółciowego i zestawu do iniekcji #2 (rurka PE50 o średnicy zewnętrznej 0,96 mm) do iniekcji żyły wrotnej. Dla młodych myszy po urodzeniu (do P30) przygotuj dwa zestawy do wstrzykiwań #1, jeden do przewodu żółciowego i jeden do wstrzykiwania do żyły wrotnej (brak zestawu do wstrzykiwań #2, ponieważ żyła wrotna jest zbyt wąska, aby pomieścić rurkę PE50).
- Aby przygotować zestaw iniekcyjny #1, odetnij 30 cm rurki PE10 i rozciągnij jeden koniec rurki ręcznie, ciągnąc ją, aż stanie się tak cienka, jak to możliwe (Rysunek 1A,B, średnica około 0,15 mm, nierozciągnięta rurka PE10 ma średnicę 0,6 mm).
- Przytnij końcówkę rozciągniętej rurki PE10 po przekątnej, aby utworzyć ściętą końcówkę (Rysunek 1B).
- Podłącz nierozciągnięty koniec rurki PE10 do igły 30 G (Rysunek 1A, Zestaw do wstrzykiwań #1).
- Aby przygotować zestaw iniekcyjny #2, odetnij 30 cm rurki PE50 i rozciągnij jeden koniec rurki ręcznie, ciągnąc ją, aż stanie się wystarczająco cienka, aby zmieścić się w żyle wrotnej (Rysunek 1A,B, około 0,7 mm, nierozciągnięta rurka PE50 ma średnicę 0,96 mm).
- Przetnij końcówkę rozciągniętej rurki PE50 po przekątnej, aby utworzyć skośną końcówkę (Rysunek 1B).
- Podłącz nierozciągnięty koniec rurki PE50 do igły 23 G (Rysunek 1A, zestaw do wstrzykiwań #2).
nuta: Każdy zestaw do wstrzykiwań może być użyty tylko do jednego wstrzyknięcia, ponieważ żywica stwardnieje w strzykawce i rurce. Dostosuj rozmiar rozciągniętej i ściętej końcówki w oparciu o rozmiar wspólnego przewodu żółciowego i żyły wrotnej myszy, w zależności od jej wieku, genotypu i fenotypu. Jeśli nie masz pewności co do rozmiaru i dopasowania rurki, włóż rurkę do odpowiedniego kanału lub naczynia po nacięciu i przed wypełnieniem rurki żywicą. Jeśli rurka jest zbyt szeroka, aby zmieścić się w kanale/naczyniu, rozciągnij ją dalej.
- Znieczulić zwierzę przez inhalację izofluranu (pierwsze 4% w komorze indukcyjnej i ~2% za pomocą stożka nosowego).
- Umieść mysz na wentylowanej ławce na podkładce preparacyjnej, podczas gdy mysz oddycha izofluranem przez stożek nosowy. Sprawdzić, czy zwierzę jest nieprzytomne za pomocą metody zalecanej przez instytut/IRB, np. poprzez uszczypnięcie jednej z łap.
ostrożność: Izofluran może powodować senność lub zawroty głowy po inhalacji oraz może powodować uszkodzenie układu sercowo-naczyniowego i ośrodkowego układu nerwowego poprzez długotrwałe lub powtarzające się narażenie. Nie wdychaj go. Z substancją należy obchodzić się na wentylowanej ławce i w dobrze wentylowanych pomieszczeniach.
nuta: Możliwe jest zastosowanie innej metody znieczulania, o ile jest ona zgodna z perfuzją serca.
- Gdy zwierzę straci przytomność, spryskaj stronę brzuszną 70% etanolem, aby zapobiec ingerencji sierści.
- Za pomocą nożyczek do skóry przetnij skórę, powięź i warstwę mięśni, zaczynając od linii środkowej jamy brzusznej i przetnij do jamy piersiowej, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
- Chwyć wyrostek mieczykowaty kleszczami, aby podnieść mostek i przeciąć przeponę i klatkę piersiową po obu stronach, aby odsłonić serce i płuca.
- Zdejmij klatkę żebrową, przecinając nożyczkami żebra po lewej i prawej stronie klatki piersiowej. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić wątroby, ponieważ spowoduje to wyciek żywicy.
- Za pomocą prostych kleszczy pociągnij serce w kierunku wątroby i odetnij prawy przedsionek.
- Wprowadzić igłę motylkową (23 G), podłączoną do perfuzyjnej pompy perystaltycznej, do lewej komory. Przeprowadzić perfuzję myszy przezskórnie zrównoważonym roztworem soli Hanksa (HBSS) i heparyną (1 U/g masy ciała myszy). Utylizuj przez 3 minuty z szybkością perfuzji 5 ml/min.
nuta: Jeśli mysz jest prawidłowo perfundowana, narządy wewnętrzne staną się blade, zwłaszcza wątroba. Jeśli zamiast tego płuca stają się białe, igła jest wprowadzana do prawej komory i powinna zostać przestawiona. Po perfuzji mysz ulega wykrwawieniu i można ją usunąć ze stożka nosowego i izofluranu.
- Wyłączyć pompę izofluranu.
2. Wtryskiwanie żywicy - Odlewanie żywicy w układzie żółciowym
- Przesuń mysz do mikroskopu preparacyjnego, brzuch do góry, ogon w kierunku eksperymentatora i odsuń się od eksperymentatora. Interesujące nas anatomiczne punkty orientacyjne przedstawiono na rysunku 2A.
- Zlokalizuj żyłę główną dolną (ryc. 2A), przesuwając jelito na bok. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj małe poprzeczne nacięcie w żyle głównej dolnej, aby umożliwić uwolnienie ciśnienia naczyniowego w wątrobie (ryc. 2Bi).
- Odsłonić wspólny przewód żółciowy i żyłę wrotną zgodnie z opisem w krokach 1.2.4-1.2.6.
- Przesuń jelito i trzustkę na prawą stronę (eksperymentatora) za pomocą wacika zwilżonego roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS).
- Odwróć brzuszną stronę wątroby w kierunku serca za pomocą bawełnianego wacika nasączonego PBS, aby odsłonić powierzchnię trzewną i obszar wnęki.
- Zlokalizuj wspólny przewód żółciowy, który biegnie od okolicy wnęki przez trzustkę i do jelita przy zwieraczu Oddiego (ryc. 2Bii, wspólny przewód żółciowy obrysowany żółtą przerywaną linią, czarne groty strzałek wskazują na zwieracz Oddi).
nuta: Upewnij się, że wątroba jest wilgotna przez cały zabieg, posypując ją PBS.
- Oczyść otaczającą tkankę (obszar ~5 mm) ze wspólnego przewodu żółciowego za pomocą prostych kleszczy. Umieść jedwabną nić do szycia (rozmiar 4-0, 0,17 mm, długość 3-5 cm) pod wspólnym przewodzie żółciowym (ryc. 2Bii) i zawiąż luźny węzeł wokół wspólnego przewodu żółciowego (ryc. 2Biii).
nuta: Wybierz obszar węzła w połowie drogi między obszarem wnęki a zwieraczem Oddiego oraz w pewnej odległości od żyły wrotnej, tak aby po zaciśnięciu szwu wokół przewodu żółciowego wspólnego nie przeszkadzał w wstrzyknięciu żyły wrotnej.
- Przytrzymaj nożyczki sprężynowe płasko przy wspólnym przewodzie żółciowym, aby wykonać ukośne nacięcie wspólnego przewodu żółciowego w miejscu, w którym wspólny przewód żółciowy wchodzi do trzustki i jelita obok zwieracza Oddi. (Ryc. 2Biv), żółta przerywana linia zarysowuje zwieracz obszaru Oddiego, podkreślony czarnymi grotami strzałek).
nuta: To kluczowy krok. Wykonaj ukośne, a nie poprzeczne cięcie i wykonaj nacięcie; Nie przecinaj przewodu żółciowego. Przecięcie całego przewodu żółciowego sprawia, że wprowadzenie rurki jest bardzo trudne.
- Tuż przed użyciem zmieszać 1 ml żółtej żywicy z 50 μl utwardzacza (napełniając i opróżniając strzykawkę o pojemności 1 ml) i napełnić strzykawkę Luer o pojemności 1 ml mieszaniną żywicy i utwardzacza.
- Połączyć napełnioną strzykawkę z rurką (zestaw #1). Nacisnąć tłok, aby całkowicie napełnić rurkę. Upewnij się, że mieszanina żywicy i utwardzacza kapie z końcówki rurki.
nuta: Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy unikać i usuwać pęcherzyki powietrza ze strzykawki i rurki.
- Za pomocą kleszczy wyprostuj obszar wokół nacięcia wspólnego przewodu żółciowego i włóż rurkę do otworu w wspólnym przewodzie żółciowym (ryc. 2Bv), najdłuższą krawędzią skośnej końcówki skierowaną w dół w kierunku grzbietowej strony przewodu żółciowego. Taka orientacja zapewnia, że żywica może wydostać się z otworu rurki, który jest skierowany do góry, do kanału (rysunek 2Bv).
- Zaciśnij węzeł jedwabnej nici, aby zabezpieczyć rurkę wewnątrz wspólnego przewodu żółciowego (rysunek 2Bvi).
- Wstrzyknąć żywicę do wspólnego przewodu żółciowego. Obserwuj woreczek żółciowy i poszczególne płaty wątroby.
- Masuj wątrobę bawełnianym wacikiem zwilżonym PBS, aby równomiernie rozprowadzić żywicę. Końcowe odgałęzienia dróg żółciowych wypełnionych żywicą (u myszy typu dzikiego) są słabo widoczne na powierzchni wątroby.
nuta: Przewidywany czas wypełnienia wątroby to 30-100 s.
- Należy przerwać wstrzykiwanie żywicy, gdy na powierzchni wątroby pojawią się kropki żywicy (ryc. 2Ci, niebieskie groty strzałek) lub gdy napotkany jest opór.
nuta: Pracuj tak szybko, jak to możliwe, ponieważ żywica zaczyna twardnieć po dodaniu utwardzacza żywicy. Czas pracy od dodania utwardzacza wynosi około 15 min.
- Usuń rurkę, wyciągając ją ze wspólnego przewodu żółciowego i szybko zaciśnij jedwabny węzeł za pomocą kleszczy, aby zapobiec wyciekaniu żywicy. Odetnij luźne końce jedwabnego szwu, aby nie przeszkadzały w wstrzyknięciu żyły wrotnej.
- Rurkę zawierającą żywicę i pozostałą żywicę należy wyrzucić do odpadów niebezpiecznych, a igłę do odpadów po ostrych narzędziach.
