$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Wypreparowanie węzła zatokowo-przedsionkowego (SAN)
- Przygotować heparynizowany roztwór Complete Tyrode do rozwarstwienia SAN.
- Dodać 400 μl heparyny (1 000 USP/ml) do 40 ml roztworu Complete Tyrode i ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
- Wstrzyknąć myszy dootrzewnowo 200-300 μl heparyny (1000 USP/mL) i pozwolić zwierzęciu siedzieć przez 10 minut.
- Poddaj eutanazji heparynową mysz przez przedawkowanie izofluranu.
- Umieść mysz w małej szklanej komorze, która zawiera opary izofluranu powstające przez dodanie 200-300 μl ciekłego izofluranu do bibuły filtracyjnej wewnątrz perforowanej plastikowej rurki.
UWAGA: Ponieważ izofluran może powodować podrażnienie skóry i może być również wchłaniany przez skórę, płyn nie powinien stykać się bezpośrednio z myszą. Dlatego chusteczkę nasączoną izofluranem umieszcza się w perforowanej tubie do podania.
- Zgon należy stwierdzić przez zaprzestanie ruchu i wysiłku oddechowego oraz przez brak odruchu szczypania palców u stóp. Śmierć trwa zwykle około 1-2 minut po umieszczeniu w komorze.
nuta: Śmierci zwykle towarzyszy oddawanie moczu.
- Umieść mysz w pozycji leżącej na desce do sekcji z wyciągniętymi łapami i przymocuj łapy do deski za pomocą igieł strzykawkowych o długości 1 cala i rozmiarze 23. Następnie usuń sierść w pobliżu dolnej części klatki piersiowej za pomocą nożyczek chirurgicznych i odcinając futro u nasady.
nuta: W przypadku deski preparacyjnej można użyć styropianowych pokryw chłodzących.
- Trzymając skórę hemostatem, użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać poprzeczne nacięcie w skórze tuż pod dnem klatki piersiowej od mniej więcej lewego łuku żebrowego do prawego łuku żebrowego (ryc. 1A).
- Rozciąć otrzewną nożyczkami chirurgicznymi i ostrożnie oddzielić wątrobę od przepony, uważając, aby nie naciąć wątroby, co spowoduje nadmierne krwawienie (ryc. 1B). Naciąć przeponę wzdłuż klatki piersiowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej (ryc. 1C-D).
- Za pomocą nożyczek chirurgicznych przeciąć boczne ściany klatki piersiowej od krawędzi łuków żebrowych aż do obojczyków, aby odsłonić serce, uważając, aby nie uszkodzić serca (ryc. 1D). Następnie użyj igły strzykawkowej o rozmiarze 23, aby przypiąć klatkę piersiową do ramienia, przytrzymując ją na miejscu i z dala od pola operacyjnego.
- Za pomocą pipety transferowej wlej ciepły (37 °C) heparynizowany roztwór Complete Tyrode na serce, aby było wilgotne.
nuta: Nie pozwól, aby serce wyschło.
- Usuń płuca, przytrzymując je bardzo cienkimi kleszczami Graefe i przecinając tchawicę nożyczkami chirurgicznymi (ryc. 1E).
- Przytrzymaj wierzchołek serca za pomocą bardzo cienkich kleszczyków Graefe i usuń go, przecinając aortę i żyły główne nożyczkami chirurgicznymi. Przenieść serce na szalkę Petriego zawierającą utwardzony elastomer silikonowy (Ryc. 2A) i za pomocą pipety transferowej wykąpać serce w 2-3 ml ciepłego (37 °C) heparynizowanego roztworu Complete Tyrode.
nuta: Należy uważać, aby nie uszkodzić delikatnej tylnej ściany prawego przedsionka, w której znajduje się SAN, oraz połączonych prawych żył przedsionkowych. Kąpiel serca roztworem Complete Tyrode zapobiega wysychaniu serca, ale nie należy całkowicie zanurzać serca w roztworze, ponieważ pogorszy to widoczność podczas sekcji.
- Ustaw serce tak, aby prawe przedsionek znajdowało się po prawej stronie eksperymentatora, a lewe przedsionek znajdowało się po lewej stronie eksperymentatora.
nuta: Wypreparowanie tkanki SAN powinno być wykonane szybko, aby zapobiec urazom związanym z niedokrwieniem.
- Przymocuj wierzchołek serca do naczynia za pomocą szpilki do rozwarstwienia. Następnie, trzymając żyłę główną dolną za pomocą kleszczy laminektomijnych Dumont #2, włóż igłę strzykawkową 22 G przez żyłę główną dolną i górną, aby zlokalizować ich położenie w prawym przedsionku, który również określa przybliżoną pozycję SAN (znajdującej się w plamie tkanki między żyłą główną dolną i górną (ryc. 2B).
- Za pomocą małych szpilek do rozwarstwiania przypnij lewy i prawy przydatek przedsionka do naczynia.
- Trzymając wyrostek lewego przedsionka za pomocą kleszczy laminektomijnych Dumont #2, włóż szpilkę do wypreparowania przez wyrostek lewego przedsionka, aby utrzymać go na miejscu.
- Przytrzymując prawy uszek przedsionka kleszczami Dumont #55, włóż szpilkę do wypreparowania przez prawy wyrostek przedsionka, aby utrzymać go na miejscu.
nuta: W razie potrzeby ten sam rodzaj kleszczy może być używany do przytrzymywania przydatków lewego i prawego przedsionka.
- Wyjąć igłę strzykawki, która obejmuje żyły główne.
- Aby uwolnić krew z serca, użyj nożyczek Castroviejo, aby usunąć wierzchołek serca (tj. dolną połowę), wykonując poprzeczne nacięcie w poprzek komór (ryc. 2C). Następnie umyć serce, dodając ciepły (37 °C) heparynizowany roztwór Complete Tyrode za pomocą pipety transferowej.
- Użyj nożyczek Castroviejo, aby przeciąć wzdłuż przegrody przedsionkowo-komorowej, utrzymując nacięcie bliżej komory niż przedsionków. Kontynuuj cięcie wzdłuż przegrody przedsionkowo-komorowej, aż przedsionki zostaną oddzielone od komór.
- Przeciąć wzdłuż przegrody międzyprzedsionkowej, aby usunąć lewy przedsionek.
- Umieść szpilki do preparowania na obrzeżach prawego przedsionka, aby leżało płasko (ryc. 2D). Usuń pozostały tłuszcz, naczynia lub tkanki z przedsionka za pomocą nożyczek Castroviejo.
- Zlokalizuj SAN w prawym przedsionku, który w tej orientacji jest w przybliżeniu otoczony żyłą główną górną (na górze), żyłą główną dolną (na dole) i cristae terminalis (po lewej) (Rysunek 2D).
UWAGA: Crista terminalis pojawia się jako ciemny muskularny grzbiet między uszkiem prawego przedsionka a SAN. Często można również zobaczyć tętnicę SAN biegnącą przez sieć SAN (rysunek 2D).
