Kolekcja White and Brown Adipose Depot od Mouse Pup: procedura chirurgiczna mająca na celu zebranie białej tkanki tłuszczowej i brązowej tkanki tłuszczowej od szczeniaka myszy

Streszczenie

Źródło: Galmozzi, A. et al. Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. J. Vis. Termin ważności (2021)

W tym filmie pokazujemy procedurę chirurgiczną polegającą na izolowaniu podskórnej białej tkanki tłuszczowej i brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami od nowonarodzonej myszy.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Zbieranie i trawienie magazynów tłuszczu (dzień 1)

1. Przygotuj dwie probówki o pojemności 1,5 ml dla każdego szczeniaka: jedną dla brązowej tkanki tłuszczowej (BAT) i jedną dla białej tkanki tłuszczowej (WAT). Do każdej probówki dodać 250 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) + 200 μl 2x buforu izolacyjnego (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl₂, 5 mM glukozy, 100 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), penicyliny-streptomycyny i 4% albuminy surowicy bydlęcej bez kwasów tłuszczowych) do każdej probówki. Roztwory należy przechowywać w sterylnych warunkach i na lodzie.
2. Umieść młode w małych komorach (np. w jednym dołku na 6-dołkowej płytce) i umieść je na lodzie, aż staną się hipotermiczne. Upewnij się, że nie ma bezpośredniego kontaktu między szczeniętami a lodem. Nakłuj łapę czubkiem, aby zapewnić utratę przytomności i poddaj szczenięta eutanazji przez ścięcie głowy ostrymi nożyczkami.
   UWAGA: w przypadku pracy z różnymi genotypami należy przygotować dodatkową probówkę do pobrania biopsji ogona (nacięcie 3 mm) w celu genotypowania. Jeśli genotypowanie zostanie przeprowadzone natychmiast, trzymaj uśpione młode na lodzie do czasu sekcji, aby zebrać magazyny tłuszczu.
3. Oblicz i zważ ilość kolagenazy potrzebną do strawienia wszystkich magazynów. Dodać 50 μl kolagenazy typu I o stężeniu 15 mg/ml w 2x buforze izolacyjnym do każdej probówki. Nie należy ponownie umieszczać kolagenazy w buforze izolacyjnym, dopóki nie zostaną zebrane wszystkie tkanki.
4. Aby pobrać podskórny WAT, przetnij skórę wokół brzucha szczeniaka (unikaj pęknięcia otrzewnej) i delikatnie pociągnij skórę w dół poniżej nóg. Nie pobierając skóry, ostrożnie zbierz magazyn tłuszczu, który pojawi się jako przezroczysta (P1 lub młodsza) lub biała (P2 i starsze), cienka, wydłużona tkanka przyczepiona po wewnętrznej stronie lub na górze mięśnia czworogłowego (ryc. 1A, B). Przepłukać magazyn tłuszczu w PBS i umieścić go w jednej z probówek zawierających 250 μL PBS + 200 μL 2x buforu izolacyjnego. Przechowywać na lodzie.
   UWAGA: Myszy P0 i P1 dają najlepszą wydajność. U szczeniąt P0-1 podskórny magazyn WAT jest prawie przezroczysty. U myszy P2 i starszych magazyn jest łatwiejszy do zidentyfikowania, ponieważ już zmienia kolor na biały, co wskazuje na obecność w pełni dojrzałych, naładowanych lipidami, białych adipocytów.
5. Aby zebrać międzyłopatkowy BAT, przeciągnij skórę od łopatek nad głowę. Podnieś BAT - ciemnoczerwoną tkankę między łopatkami - i ostrożnie wykonaj nacięcia wokół niej, aby oderwać ją od ciała (ryc. 1A, B). Sprawdź konsystencję i kolor; spłukać PBS; umieścić go w drugiej probówce zawierającej 250 μL PBS + 200 μL 2x buforu izolacyjnego; i trzymaj na lodzie.
   UWAGA: Podczas zbierania BAT od myszy P2 i starszych należy ostrożnie usunąć białą tkankę tłuszczową otaczającą BAT. Składa się z cienkiego, miękkiego, białego arkusza adipocytów znajdujących się między skórą a BAT, który znajduje się głębiej między łopatkami.

Wyniki

Rysunek 1: Zbieranie i przetwarzanie poduszek tłuszczowych. (A) Schematyczne przedstawienie pierwotnej białej (na górze) i brązowej (na dole) izolacji adipocytów. (B) Podskórne białe (na górze) i brązowe (na dole) magazyny tłuszczu. U myszy P0 podskórny WAT jest prawie niewidoczny, ale staje się rozpoznawalny w ~ dniu 2 po urodzeniu. Natomiast BAT ma wyraźny ciemny ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki 6-dołkowe	Corning	353046
BSA bez kwasów tłuszczowych	Sigma-Aldrich	A8806
CaCl2	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C4901
glukoza	Sigma-Aldrich	Kontroler G7021
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375
Kcl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9333
Zawartość NaCl	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7653
Pióro/Paciorkowiec	Gibco (firma Gibco)	15140122
Kleszcze chirurgiczne	Instrument chirurgiczny ROBOZ Co	Złącze RS-5158
Nożyczki chirurgiczne	Instrument chirurgiczny ROBOZ Co	Złącze RS-5880
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Gibco (firma Gibco)	14190144

powiedział: powiedział: powiedział: