Generowanie modelu infekcji dróg moczowych: technika podawania bakterii uropatogennych u myszy w celu opracowania modelu infekcji dróg moczowych

Streszczenie

Źródło: Luyts, N. et al., Longitudinal Follow-Up of Urinary Tract Infections and Their Treatment in Mice Using Bioluminescence Imaging. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie opisujemy technikę dopęcherzowego podawania bakterii uropatogennych w celu wygenerowania modelu infekcji dróg moczowych u myszy. Model ten może być wykorzystany do zrozumienia rozprzestrzeniania się uropatogennej infekcji bakteryjnej w obrębie układu moczowego oraz mechanizmów określających podatność na ZUM.

Protokół

1. Szczepienie zwierząt

1. Przygotowanie zwierząt
   1. Wybierz żądany szczep myszy w zależności od pytania badawczego i dostępności linii nokautujących, szczegółów eksperymentalnych i różnic w podatności na ZUM. Należy pamiętać, że cewnikowanie przezcewkowe jest łatwiejsze u samic myszy. Nie należy używać zwierząt w wieku poniżej 8 tygodni, ponieważ są one niedojrzałe immunologicznie. W tym przypadku wykorzystano 12-tygodniowe samice myszy C57Bl/6J.
   2. Zamów zwierzęta z dużym wyprzedzeniem i pozwól im się zaaklimatyzować, najlepiej na 7 dni. Grupuj zwierzęta domowe w indywidualnie wentylowanych klatkach, w standardowych 12-godzinnych warunkach światła/ciemności.
   3. Ogol okolice brzucha zwierząt, aby ograniczyć utratę sygnału. Nie używaj kremu do depilacji, ponieważ może on szybko poparzyć skórę zwierząt. Skrępuj zwierzę, mocno trzymając kark i tylne kończyny ręką niedominującą, jednocześnie goląc się ręką dominującą. Alternatywnie należy golić się w znieczuleniu izofluranowym.
      nuta: Zwierzęta były golone 2 dni przed obrazowaniem, biorąc pod uwagę, że zwierzęta będą jeszcze bardziej pielęgnować ogolony obszar.
   4. Zapewnij wodę i standardowe jedzenie ad libitum przez cały czas trwania eksperymentu. Należy jednak pozbawić zwierzęta wody na 2 godziny przed wkropleniem, aby zminimalizować objętość pęcherza podczas wkraplania.
   5. Zamontuj sterylną końcówkę angioctownika 24 G na strzykawce o pojemności 100 μl i napełnij strzykawkę roztworem bakteryjnym.
2. Wciąganie zwierząt
   1. Umieścić zwierzęta w komorze indukcyjnej i znieczulić je za pomocą inhalacji izofluranu z czystym tlenem jako gazem nośnym (indukcja w stężeniu 3% i utrzymanie w stężeniu 1,5%).
   2. Umieścić jedno zwierzę na powierzchni roboczej w pozycji leżącej na plecach i utrzymywać stabilne znieczulenie izofluranem za pomocą stożka nosowego podczas wkraplania. Nałóż maść do oczu.
   3. Wydal zalegający mocz, stosując delikatny ucisk i wykonując okrężne ruchy w okolicy nadłonowej. Przed wkropleniem oczyść dolną część brzucha 70% etanolem.
   4. Nasmaruj końcówkę cewnika zwykłą solą fizjologiczną. Połóż palec wskazujący ręki niedominującej na brzuchu i delikatnie popchnij go do góry. Rozpocznij cewnikowanie cewki moczowej pod kątem 90° (w pionie), a po napotkaniu oporu przechyl ją w poziomie przed włożeniem jej dalej (0,5 cm).
      nuta: Nigdy nie należy naciskać cewnika na siłę, ponieważ spowoduje to uszkodzenie cewki moczowej. Delikatne ruchy obrotowe mogą być pomocne we wprowadzaniu cewnika. Z drugiej strony brak oporu zwykle wskazuje na błędne wprowadzenie do pochwy.
   5. Wykonać powolne (5 μl/s) wkraplanie 50 μl inokulum bakteryjnego (2 x 10⁷ CFU).
      nuta: Większe objętości lub szybsze wkraplanie mogą powodować refluks do nerek. Podczas praktyki tej techniki niebieski atrament może być używany do oceny refluksu.
   6. Po wkropleniu należy przytrzymać strzykawkę i cewnik na miejscu jeszcze przez kilka sekund, a następnie powoli wycofać, aby zapobiec wyciekowi. Rejestruj wszelkie nieprawidłowości, takie jak duża ilość wycieku lub krwawy ujści, i w razie potrzeby wyklucz zwierzęta.
   7. Ustawić zwierzę w pozycji leżącej na stożku nosowym komory obrazowania i powtórzyć poprzednie kroki 1.1.1-1.1.6 dla wszystkich pozostałych zwierząt. Użyj jednego cewnika na grupę eksperymentalną. Upewnij się, że znieczulenie jest kontynuowane i zminimalizuj czas między pierwszym a ostatnim zwierzęciem.
   8. W razie potrzeby należy podać antybiotyki lub leki eksperymentalne przed lub po obrazowaniu (krok 3). Na przykład, aby podać enrofloksacynę, dodaj 40 μl roztworu enrofloksacyny (100 mg/ml) do 3,96 ml soli fizjologicznej, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100. Wstrzyknąć 100 μl/10 g podskórnie o godz. 9 rano i 17 po południu, aby podawać 10 mg/kg enrofloksacyny dwa razy na dobę przez 3 dni.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Aesculap ISIS	Aesculap	Zobacz materiał GT421	trymer do włosów, z nasadką GT608
Waporyzator anestezjologiczny	Ograniczona aparatura Harvarda	N/a	https://www.harvardapparatus.com/ harvard-apparatus-anestheticvaporizers.html
BD Insyte Autoguard 24 GA	Bd	382912	Żółty angiocewnik, do wkraplania użyj sterylnej plastikowej końcówki
Myszy C57Bl/6J	Janvier	N/a
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, Gibco	ThermoFisher Naukowy	REF 14040-083
Etanol 70% denaturowany 5L	VWR Polska	85825360
Strzykawka Hamilton GASTIGHT, PTFE Luer Lock, 100 μL	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 26203	w celu zapewnienia powolnego wkraplania bakterii 50 μL
Iso-Vet 1000mg/g	Dechra Produkty weterynaryjne	N/a	Izofluran