Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Izolacja mięśni EDL i trawienie kolagenazy
- Spryskaj wszystkie urządzenia 70% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia.
- Złóż mysz w ofierze zgodnie z krajowymi przepisami dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach.
- Spryskaj tylne kończyny myszy 70% etanolem. Użyj utwardzonych, cienkich, zakrzywionych nożyczek (krawędź tnąca 24 mm) i cienkich kleszczy (Dumont 7, zakrzywionych lub prostych), aby usunąć skórę i odsłonić leżące pod nią mięśnie. Unikaj kontaktu leżących pod spodem mięśni z sierścią (zwiększa ryzyko zanieczyszczenia).
- Usuń otaczającą powięź za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy, nie uszkadzając leżących poniżej mięśni (ryc. 1A). Zamknij kleszcze, aby uniknąć zginania.
- Użyj zakrzywionych kleszczy, aby odsłonić dystalne ścięgna TA (piszczelowy przedni) i mięsień EDL. Aby usunąć TA, chwyć dystalne ścięgno TA kleszczami i przetnij cienkimi nożyczkami sprężynowymi Vannas (krawędź tnąca 5 mm, średnica końcówki 0,35 mm). Trzymając TA na ścięgnie, pociągnij je w kierunku kolana i przetnij mięsień blisko kolana (ryc. 1B), mięsień EDL jest teraz odsłonięty.
nuta: Upewnij się, że na tym etapie chwytane jest tylko ścięgno TA, w przeciwnym razie leżący pod spodem EDL może ulec uszkodzeniu. Odcinając mięsień TA, upewnij się, że ścięgna w kolanie są później łatwo widoczne.
- Podnieś dystalne ścięgno EDL za pomocą cienkich zakrzywionych kleszczy i przetnij cienkimi nożyczkami sprężynowymi Vannas (Rysunek 1C). Odsłoń proksymalne ścięgno EDL, ostrożnie pociągając EDL w kierunku kolana. Przetnij ścięgno bliższe cienkimi nożyczkami sprężynowymi Vannas. Przenieść mięsień EDL do podgrzanego w temperaturze 37°C roztworu do trawienia kolagenazy w temperaturze 2,5 ml w probówce reakcyjnej o pojemności 15 ml. Roztwór kolagenazy przygotowuje się zgodnie z tą procedurą:
- Przygotować roztwór do wytrawiania kolagenazy, rozpuszczając 0,2% (w/v) kolagenazy typu 1 (z Clostridium histolyticum) w DMEM (zmodyfikowane podłoże Eagle's firmy Dulbecco z 4,5 g/l glukozy i pirogronianem sodu), przefiltrować przez filtr 0,22 μm. (Rysunek 1D).
nuta: Wykonaj małe nacięcie na zewnętrznej stronie tkanki łącznej kolana, aby w pełni odsłonić proksymalne ścięgno EDL. Upewnij się, że chwytasz tylko ścięgna i nie rozciągasz zbytnio EDL.
- Powtórz kroki od 1.3. do 1.6 z drugim EDL. Dodaj oba mięśnie EDL do tej samej 15 ml probówki reakcyjnej wypełnionej 2,5 ml roztworu do trawienia kolagenazy.
- Inkubować mięśnie EDL w probówce reakcyjnej w temperaturze 37°C w krążącej łaźni wodnej.
nuta: Czas inkubacji zależy od kilku czynników, takich jak aktywność kolagenazy, wiek myszy i ilość tkanki zwłóknieniowej. Typowy czas inkubacji mięśni EDL dorosłych myszy (w wieku 2-6 miesięcy) wynosi 1-1,5 godziny, a dla myszy w wieku 18 miesięcy 1,5-2 godziny.
- Aby uniknąć nadmiernego trawienia mięśni, sprawdzaj mięśnie w czasie trawienia. Przerwij trawienie, gdy mięśnie rozluźnią się i widoczne są pojedyncze włókna mięśniowe (ryc. 1E). Ostrożnie przenieś mięśnie pipetą o dużym otworze do pierwszego dołka wstępnie podgrzanej 12-dołkowej płytki zawierającej pożywkę izolacyjną z włókien mięśniowych (ryc. 1G), którą przygotowuje się w następujący sposób:
- Uzupełnij DMEM (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco z 4,5 g/l glukozy i pirogronianem sodu) z 20% FBS (płodowa surowica bydlęca), przefiltruj przez filtr 0,22 μm. Dodać pożywkę do wstępnie pokrytych płytek izolacyjnych (płytka 12-dołkowa, 2-4 ml pożywki izolacyjnej na studzienkę) około 30 minut przed izolacją i zrównoważyć w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37°C z 5% CO2 .
2. Dysocjacja włókien miowodnych
- Do wykonania kolejnych czynności należy użyć stereoskopowego mikroskopu dwuokularowego, najlepiej wyposażonego w płytę grzewczą (37 °C). Użyj pipety o dużym otworze, aby przepłukać mięśnie ciepłym medium izolacyjnym, aż do uwolnienia pojedynczych włókien mięśniowych. Oddziel mięśnie za pomocą pipety o dużym otworze, aż pożądana liczba włókien mięśniowych będzie swobodnie unosić się w roztworze.
nuta: Unikaj nadmiernego rozcierania, aby zmniejszyć ryzyko uszkodzenia włókien mięśniowych. Zdecydowanie zaleca się stosowanie płyty grzewczej do dysocjacji włókien mięśniowych, ponieważ temperatura spada podczas procesu izolacji, co spowoduje śmierć włókien mięśniowych.
