$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie rurki do zbioru
- Umieść sterylne szklane koraliki o średnicy 1 mm w probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml.
- Wysterylizuj te probówki w autoklawie na sucho. Przed użyciem pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej.
- Dodaj 10 ml 1x sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
- Dodać 1 tabletkę koktajlu inhibitorów proteazy do probówki. Wymieszaj przez wirowanie.
- Odpipetować 400 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej inhibitor proteazy do każdej autoklawizowanej probówki do zbioru. Oznacz probówki i umieść na lodzie. (Rysunek 1A).
2. Zbieranie oczu
- Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
- Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO2 . Użyj metody wtórnej, aby potwierdzić eutanazję.
- Trzymaj uśpioną głowę myszy bezpiecznie i otwórz kleszcze z cienką końcówką po obu stronach zainfekowanego oka. Popchnij w dół w kierunku głowy, aby podeprzeć oko. Gdy szczypce znajdą się za gałką oka, ściśnij szczypce razem. Odciągnij kleszcze od głowy, aby odłączyć gałkę oczną (ryc. 1B).
- Natychmiast umieść gałkę oczną w oznakowanej tubie do zbioru. Umieść probówki na lodzie na nie dłużej niż 60 minut (Rysunek 1C).
3. Liczba bakterii wewnątrzgałkowych
- Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
- Upewnij się, że wszystkie probówki do pobierania są szczelnie zamknięte i zrównoważone, gdy znajdują się w homogenizatorze tkanek (Rysunek 2A). Włącz homogenizator tkankowy na 1 minutę, aby homogenizować próbki. Odczekaj 30 sekund, a następnie włącz na kolejną minutę. Umieść rurki na lodzie (Rysunek 2B,C).
- Seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę 10-krotnie, przenosząc kolejno 20 μl homogenatu do 180 μl sterylnego 1x PBS. Rozcieńczyć do osiągnięcia współczynnika 10-7 (rysunek 2D).
- Oznacz każdy rząd ciepłej, kwadratowej płytki BHI odpowiednimi współczynnikami rozcieńczenia. Przenieść 10 μl każdego rozcieńczenia z rzędu na górną płytkę BHI, która jest nachylona pod kątem około 45°. Pozwól próbce płynąć, aż prawie dotrze do dna płytki, a następnie połóż płytkę płasko (Rysunek 2E).
- Gdy próbka zostanie wchłonięta przez agar BHI, przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C. Kolonie powinny zacząć być widoczne po 8 godzinach od umieszczenia w inkubatorze.
- Wyjmij płytkę z inkubatora, zanim wzrost kolonii B. cereus zakłóci identyfikację poszczególnych kolonii (ryc. 2F).
- Aby uzyskać dokładne odwzorowanie stężenia w próbce, policz wiersz, który ma od 10 do 100 kolonii. Na przykład rząd o frakcji rozcieńczenia 10-4, który ma 45 kolonii, będzie miał stężenie 4,5 x 105 CFU/ml.
- Aby obliczyć całkowitą liczbę bakterii na oko, pomnóż stężenie przez 0,4, co odpowiada mililitrowej objętości 1x PBS użytej do homogenizacji oka. Na przykład stężenie 4,5 x 105 CFU/ml przełożyłoby się na 1,8 x 105 CFU B. cereus na oko.
