Test ilościowy infekcji bakteryjnych: metoda ilościowego określania wewnątrzgałkowego obciążenia bakteryjnego w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie rurki do zbioru

1. Umieść sterylne szklane koraliki o średnicy 1 mm w probówkach z nakrętką o pojemności 1,5 ml.
2. Wysterylizuj te probówki w autoklawie na sucho. Przed użyciem pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej.
3. Dodaj 10 ml 1x sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
4. Dodać 1 tabletkę koktajlu inhibitorów proteazy do probówki. Wymieszaj przez wirowanie.
5. Odpipetować 400 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej inhibitor proteazy do każdej autoklawizowanej probówki do zbioru. Oznacz probówki i umieść na lodzie. (Rysunek 1A).

2. Zbieranie oczu

1. Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
2. Poddaj mysz eutanazji przez wdychanie CO₂ . Użyj metody wtórnej, aby potwierdzić eutanazję.
3. Trzymaj uśpioną głowę myszy bezpiecznie i otwórz kleszcze z cienką końcówką po obu stronach zainfekowanego oka. Popchnij w dół w kierunku głowy, aby podeprzeć oko. Gdy szczypce znajdą się za gałką oka, ściśnij szczypce razem. Odciągnij kleszcze od głowy, aby odłączyć gałkę oczną (ryc. 1B).
4. Natychmiast umieść gałkę oczną w oznakowanej tubie do zbioru. Umieść probówki na lodzie na nie dłużej niż 60 minut (Rysunek 1C).

3. Liczba bakterii wewnątrzgałkowych

1. Wykonaj wszystkie procedury opisane w tej sekcji w warunkach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
2. Upewnij się, że wszystkie probówki do pobierania są szczelnie zamknięte i zrównoważone, gdy znajdują się w homogenizatorze tkanek (Rysunek 2A). Włącz homogenizator tkankowy na 1 minutę, aby homogenizować próbki. Odczekaj 30 sekund, a następnie włącz na kolejną minutę. Umieść rurki na lodzie (Rysunek 2B,C).
3. Seryjnie rozcieńczyć każdą próbkę 10-krotnie, przenosząc kolejno 20 μl homogenatu do 180 μl sterylnego 1x PBS. Rozcieńczyć do osiągnięcia współczynnika ^10-7 (rysunek 2D).
4. Oznacz każdy rząd ciepłej, kwadratowej płytki BHI odpowiednimi współczynnikami rozcieńczenia. Przenieść 10 μl każdego rozcieńczenia z rzędu na górną płytkę BHI, która jest nachylona pod kątem około 45°. Pozwól próbce płynąć, aż prawie dotrze do dna płytki, a następnie połóż płytkę płasko (Rysunek 2E).
5. Gdy próbka zostanie wchłonięta przez agar BHI, przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C. Kolonie powinny zacząć być widoczne po 8 godzinach od umieszczenia w inkubatorze.
6. Wyjmij płytkę z inkubatora, zanim wzrost kolonii B. cereus zakłóci identyfikację poszczególnych kolonii (ryc. 2F).
7. Aby uzyskać dokładne odwzorowanie stężenia w próbce, policz wiersz, który ma od 10 do 100 kolonii. Na przykład rząd o frakcji rozcieńczenia ^10-4, który ma 45 kolonii, będzie miał stężenie 4,5 x 10⁵ CFU/ml.
8. Aby obliczyć całkowitą liczbę bakterii na oko, pomnóż stężenie przez 0,4, co odpowiada mililitrowej objętości 1x PBS użytej do homogenizacji oka. Na przykład stężenie 4,5 x 10⁵ CFU/ml przełożyłoby się na 1,8 x 10⁵ CFU B. cereus na oko.

Rycina 1: Pobieranie zainfekowanego oka myszy. Po infekcji, po upływie pożądanego punktu czasowego, zbierz zainfekowane oczy myszy za pomocą sterylnej pęsety. (A) PBS zawierający sterylne kulki szklane. (B) Pobranie zakażonego oka. (C) Probówka żniwna zawierająca oko myszy.

Rycina 2: Przetwarzanie pobranego oka pod kątem liczby bakterii wewnątrzgałkowych. (A) Probówka do pobierania z zainfekowanym okiem mocno zaciśniętym na homogenizatorze tkankowym. (B) Zainfekowane oczy homogenizowano dwukrotnie przez 1 minutę każde. Śledzić rozcieńczenie (D) homogenatów oka (C) i następnie posiew (E) w celu oceny ilościowej bakterii. (E) Reprezentatywna osobnika kolonii Bacillus cereus po rozcieńczeniu toru.