Ładowanie kulek w celu wprowadzenia kwasów nukleinowych do przylegających komórek hodowlanych: technika ładowania plazmidów kodujących białka fluorescencyjne do przylegających komórek ssaków

Streszczenie

Źródło: Cialek, C. A. et al. Koraliki ładują białka i kwasy nukleinowe do przylegających komórek ludzkich. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie opisujemy procedurę wprowadzania kwasów nukleinowych do przylegających komórek ssaków za pomocą ładowania koralików.

Protokół

1. Komórki wczytujące koraliki

UWAGA: Jeśli to konieczne, krótko przemyj komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie dodaj 2 ml optymalnej pożywki. Inkubować przez co najmniej 30 minut.

1. Przygotuj roztwór o objętości 3-8 μl zawierający pożądane plazmidy, białko i/lub cząstki. Użyj ~1 μg (0,1-1 pmol) każdego typu plazmidu i ~0,5 μg (0,01 nmol) białka, w zależności od wymagań eksperymentalnych. Użyj rurki o niskiej retencji do białek, aby nie pozostały one na ściankach rurki. Doprowadzić roztwór do minimum 3 μl za pomocą PBS i dostosować objętość roztworu tak, aby pokryć cały obszar komórek, które mają być załadowane (tj. mikrostudzienkę komory, rysunek 1B).
2. Dokładnie wymieszać roztwór, pipetując w górę i w dół i/lub przesuwając probówkę. Na krótko odwiruj roztwór do dna probówki w stołowym mikrofuge.
3. Przenieś roztwór ładujący kulki i komorę komórek do kaptura do hodowli tkankowej. Pozostałe kroki należy wykonać w kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnej techniki.
4. Usuń pożywkę z komórek i tymczasowo przechowuj ją w sterylnej probówce. Delikatnie zassaj całe medium z okolic krawędzi komory i przechyl komorę pod kątem około 45° i usuń pozostałą kroplę pożywki ze środkowej mikrostudzienki. Podczas usuwania podłoża należy unikać dotykania końcówki pipety do szkła, co może spowodować łuszczenie się i utratę komórek. Przejdź szybko do następnego kroku, aby komórki nie wyschły długo.
5. Delikatnie odpipetuj roztwór ładujący kulki do szklanej mikrostudzienki na środku komory. Opcjonalnie: Inkubować z delikatnym kołysaniem przez ~30 s, nie dopuszczając do całkowitego wyschnięcia komory.
6. Delikatnie rozprowadź monowarstwę szklanych kulek na wierzchu komórek, najlepiej za pomocą urządzenia do ładowania kulek (rysunek 1A). Upewnij się, że kulki całkowicie zakrywają komórki w mikrostudzience ze szklanym dnem.
7. Ściskając komorę dwoma palcami, uderz nią o powierzchnię okapu, podnosząc ją na ~2 cale i mocno opuszczając. Użyj siły w przybliżeniu równej upuszczeniu naczynia z tej wysokości. Powtórz w sumie ~10 stuknięć.
   nuta: Upewnij się, że krany nie odklejają się znacząco od komórek. Stukanie można zoptymalizować pod kątem typu ogniwa. Jeśli komórki ładują się słabo, stuknij mocniej; Jeśli jednak wiele komórek odkleja się, stuknij delikatniej.
8. Delikatnie dodaj pożywkę z powrotem do komory, powoli pipetując na plastikową stronę komory. Spróbuj zassać wszelkie pływające koraliki bez naruszania komórek. Na tym etapie dodaj więcej wstępnie podgrzanego nośnika, jeśli usunięto zbyt dużo. Inkubować komórki przez 0,5-2 godziny w inkubatorze.

Wyniki

Rysunek 1: Aparatura do ładowania kulek, technika i oś czasu

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szalki do hodowli komórkowych 10 cm	Firma VWR	Numer katalogowy: 82050-916	Służy do hodowli komórek
Szalki do hodowli komórkowych 35 mm	sokół	353001	Służy do budowy ładowarki ściegów
Komora komórkowa Attofluor	Thermo Fisher Naukowy	Certyfikat A7816	Służy do konstruowania niestandardowego ładowarki ściegów
DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminy	Thermo Fisher Naukowy	11960069	Stosowanie w ogólnej hodowli komórkowej
Naczynia szklane z dnem, 35 mm, #1.5, szkło 14 mm	Korporacja MatTek	P35G-1.5-14-C	Komórki nasienne do tych komór w celu obrazowania
Koraliki szklane, myte kwasem, ≤106 μm	Millipore Sigma	G4649	Posyp komórki, aby załadować plazmidowe DNA i białka
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Thermo Fisher Naukowy	Zobacz materiał AM9625	Zapas roboczy sterylnego 1X PBS
DMEM bez fenolu	Thermo Fisher Naukowy	31053036	Stosować na komórkach przed obrazowaniem
Opti-MEM, Zredukowana pożywka w surowicy	Thermo Fisher Naukowy	31985070	Optymalna pożywka do inkubacji komórek przed załadowaniem ściegu (krok opcjonalny)

powiedział: