Dostarczanie kwasu nukleinowego w oparciu o nanoostrza: technika dostarczania kompleksu Cas9-sgRNA do komórek docelowych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych

Streszczenie

Źródło: Mangeot, P. E., et al. Dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych ("nanoostrzy"). J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje technikę dostarczania kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9-sgRNA do komórek docelowych w celu edycji genomu za pomocą nanoostrzy. Nanoostrza to cząsteczki wirusopodobne pozbawione zdolności do namnażania się i infekowania sąsiednich komórek, dlatego są bardzo przydatne do szybkiego i zależnego od dawki transportu bio- i nanomateriałów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Projektowanie i klonowanie sgRNA

UWAGA: Wytyczne dotyczące projektowania sgRNA można uzyskać z wielu źródeł, takich jak https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing lub od Hanna i Doench.

1. Po zaprojektowaniu 20 sekwencji nukleotydowych sgRNA zamów następujące jednoniciowe oligonukleotydy DNA:
   1. Do przodu: 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N odpowiada docelowemu locus bez sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM))
   2. Rewers: 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N odpowiada odwrotnemu uzupełnieniu docelowego locus bez sekwencji PAM)
      nuta: Przy zamawianiu oligonukleotydów nie są wymagane żadne specjalne modyfikacje (nie ma wymogu stosowania fosforanu 5').
2. Zhybrydyzować dwa oligonukleotydy DNA w probówce o pojemności 0,2 ml w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), mieszając 5 μl buforu do wyżarzania (500 mM NaCl; 100 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM DTT; pH 7,9 w 25 °C), 1 μl każdego oligonukleotydu DNA (100 μM roztworu podstawowego w wodzie) i 42 μL wody.
3. Na bloku PCR inkubować próbki w temperaturze 95 °C przez 15 sekund, a następnie zmniejszyć temperaturę do 20 °C z krokiem 0,5 °C/s. Przechowywać w temperaturze pokojowej lub przechowywać w temperaturze -20 °C.
   nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
4. Trawić 10 μg plazmidów ekspresyjnych sgRNA BLADE lub SUPERBLADE z 10 jednostkami enzymu restrykcyjnego BsmBI-v2 przez 3 godziny w temperaturze 55 °C w całkowitej objętości reakcji 50 μL.
   nuta: Strawiony wektor powinien uwolnić wstawkę DNA o wielkości ~1,9 kb i drugi fragment DNA o wielkości ~3,3 kb.
5. Załadować reakcję restrykcyjną na 1% żel agarozowy barwiony 5 μg/ml bromku etydyny (lub bezpieczniejszym alternatywnym barwnikiem w żelu DNA).
   nuta: Podczas manipulowania bromkiem etydyny, który podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne, należy nosić odpowiedni sprzęt ochronny.
   1. Na stole ultrafioletowym (UV) ustawionym na długość fali 312 nm (aby uniknąć uszkodzenia DNA) wyciąć fragment DNA o wielkości 3,3 kb z żelu i umieścić go w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Nosić odpowiedni sprzęt ochronny (rękawice i okulary chroniące przed promieniowaniem UV) podczas manipulowania bromkiem etydyny i pracy na stole UV.
   2. Ekstrahować DNA z pokrojonego żelu zawierającego 3,3 kb fragmentu DNA za pomocą dedykowanego zestawu do ekstrakcji żelu DNA (patrz tabela materiałów). Określić ilościowo ilość oczyszczonego DNA za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
6. Zliguj zhybrydyzowane oligonukleotydy DNA do przodu i do tyłu z kroku 1.2 do trawionego przez BsmB1, oczyszczonego żelem wektora BLADES lub SUPERBLADE z kroku 1.5.2. W tym celu dodać 2 μl buforu ligazy DNA T4, 50 ng wektora oczyszczonego żelem (z kroku 1.5.2), 1 μl zhybrydyzowanych oligonukleotydów DNA (z kroku 1.2), wodę w celu uzupełnienia objętości do 19 μl i 1 μl ligazy DNA T4. Inkubować reakcję w temperaturze 25 °C przez 10 minut.
   1. Przekształć produkt ligacji w kompetentne bakterie (patrz Tabela materiałów). Przekształcone bakterie umieścić na płytce z agarem ampicyliny Luria Bertani i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   2. Wybierz kilka izolowanych kolonii na płytce agarowej, aby przeprowadzić minipreparat DNA (patrz Tabela materiałów) i wykonaj sekwencjonowanie Sangera przy użyciu startera U6 do przodu (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3'), aby sprawdzić poprawność ligacji sekwencji zmiennej sgRNA.
      UWAGA: Inne plazmidy ekspresyjne sgRNA mogą być używane, jeśli nie kodują białka Cas9, co może zakłócać produkcję Nanoblade.

2. Przygotowanie plazmidu

1. Przeprowadzić maxipreparation (patrz Tabela Materiałów) wszystkich wymaganych plazmidów i przygotować 10 μg porcji w stężeniu 1 μg/ml do przechowywania w temperaturze -20 °C. Unikać powtarzających się cykli zamrażania/rozmrażania plazmidów; użyć podwielokrotności dwukrotnie przed ich wyrzuceniem.

3. Przygotowanie nanoostrzy

1. W dniu 1 wysiewaj od 3,5 do 4 × 10⁶ HEK293T komórek (patrz tabela materiałów) w 10 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego wysoką glukozę, pirogronian sodu, L-glutaminę, 10% płodową surowicę bydlęcą (FBS) i penicylinę/streptomycynę w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórkowych. Delikatnie przesuń płytkę o średnicy 10 cm do tyłu i do przodu, a następnie od prawej do lewej (powtórz tę sekwencję 5x), aby równomiernie rozprowadzić komórki na szalce hodowlanej. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym z 5% CO₂,
   nuta: Wszystkie procedury związane z obchodzeniem się z hodowanymi komórkami i nanoostrzami powinny być wykonywane pod okapem z przepływem laminarnym do hodowli komórkowych, aby uniknąć ich zanieczyszczenia.
2. Dzień 2: Transfekcja plazmidu
   1. Komórki powinny być zlewane w 70-80% 24 godziny po posiewie (ryc. 1A). Zastąp pożywkę 10 ml świeżego DMEM zawierającego wysoki poziom glukozy, pirogronian sodu, L-glutaminę, 10% FBS (penicylinę i streptomycynę można pominąć, chociaż nie jest to obowiązkowe) przed transfekcją.
      UWAGA: Na tym etapie ważne jest, aby komórki nie zlewały się. W przeciwnym razie wydajność transfekcji, a także produkcja cząstek mogą zostać zmniejszone.
   2. Na każdą 10 cm płytkę przygotuj następujące ilości plazmidów w probówce o pojemności 1,5 ml: 0,3 μg pCMV-VSV-G, 0,7 μg pBaEVRless, 2,7 μg MLV Gag/Pol, 1,7 μg BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg plazmidu BLADES lub SUPERBLADES kodującego sklonowane sgRNA (lub 2,2 μg każdy, jeśli używasz dwóch sgRNA).
   3. Dodać 500 μl buforu do transfekcji (patrz tabela materiałów), wirować przez 10 s, a następnie wirować przez 1 s. Dodać 20 μl odczynnika do transfekcji (patrz tabela materiałów), wirować probówkę przez 1 s, a następnie wirować przez 1 s.
   4. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej i dodawać cały roztwór kroplami do komórek w pożywce DMEM za pomocą pipetora P1000. Delikatnie przesuwaj płytkę o średnicy 10 cm do tyłu i do przodu, a następnie od prawej do lewej (powtórz tę sekwencję 5x), aby równomiernie rozprowadzić odczynnik do transfekcji na komórkach. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 40 godzin w inkubatorze komórkowym z 5% CO₂,
      nuta: W razie potrzeby podłoże można zmienić 4 godziny po transfekcji.
3. W dniu 3 sprawdź morfologię transfekowanych komórek pod mikroskopem.
   nuta: Komórki producenta zaczną się łączyć. Jest to normalne zjawisko ze względu na ekspresję fuzogennych otoczek wirusowych (ryc. 1B, C).
4. Dzień 4: Zbiór Nanoostrzy
   nuta: Co najmniej 40 godzin po transfekcji komórki połączyłyby się ze sobą z powodu ekspresji fuzogennych otoczek wirusowych, a czasami komórki są całkowicie oderwane od nośnika płytki (ryc. 1D).
   1. Zebrać 9 ml supernatantu pożywki za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
      nuta: Nanoostrza to VLP zdolne do dostarczania białka Cas9 i związanego z nim sgRNA do komórek pierwotnych i in vivo. Chociaż nie są uważane za organizmy modyfikowane genetycznie, ponieważ są pozbawione materiału genetycznego, mogą wywoływać zmiany genetyczne. Dlatego należy z nimi manipulować ostrożnie, aby uniknąć kontaktu z użytkownikami (zwłaszcza jeśli są zaprogramowane do celowania w geny supresorowe nowotworu). Użytkownikom zaleca się przestrzeganie lokalnych wytycznych bezpieczeństwa dotyczących manipulacji wektorami retrowirusowymi i pracę w laboratorium na poziomie BSL-2 podczas przygotowywania VLP i przeprowadzania eksperymentów transdukcji. Nanoostrza można inaktywować 70% etanolem lub 0,5% podchlorynem sodu. Zaleca się również traktowanie wszystkich odpadów z tworzyw sztucznych (końcówki pipet, płytki do hodowli tkankowych, probówki wirówkowe) 0,5% podchlorynem sodu przez co najmniej 10 minut w celu dezaktywacji nanoostrzy.
   2. Odwirować zebrany supernatant o stężeniu 500 × g przez 5 minut w celu usunięcia resztek komórkowych i odzyskania supernatantu bez naruszania osadu komórkowego.
      UWAGA: Jeśli nanoostrza mają być używane na ogniwach pierwotnych, przefiltruj supernatant za pomocą filtra 0,45 μm lub 0,8 μm. Należy pamiętać, że ten krok drastycznie zmniejsza miano Nanoblade, ponieważ znaczna frakcja zostanie zablokowana w membranie filtra.
   3. Nanoostrza należy granulować przez noc (12-16 godzin) w obracającym się wirniku kubełkowym o masie 4 300 × g lub o masie 209 490 × g w ultrawirówce przez 75 minut w temperaturze 4 °C (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Jeśli komórki docelowe mogą rosnąć w DMEM, możliwe jest ich inkubowanie bezpośrednio z supernatantem otrzymanym po kroku 3.4.2 bez koncentracji nanoostrzy.
5. Dzień 5: Ponowne zawieszenie i przechowywanie Nanoostrzy
   1. Po odwirowaniu powoli zassać pożywkę i ponownie zawiesić biały osad ze 100 μl zimnej soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS). Przykryj probówkę parafilmem i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, delikatnie mieszając, a następnie ponownie zawiesić osad przez pipetowanie w górę i w dół.
      nuta: Po ponownym sporządzeniu zawiesiny może pojawić się biała, lepka substancja; Jest to normalne i nie wpływa znacząco na wydajność transdukcji.
   2. Przechowuj Nanoblades w temperaturze 4 °C, jeśli planujesz użyć ich w ciągu czterech tygodni. W przeciwnym razie należy zamrozić nanoostrza w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Podczas manipulowania ciekłym azotem należy nosić okulary ochronne i rękawice kriogeniczne. Szybkie zamrażanie i przechowywanie w temperaturze -80 °C prowadzi do znacznego spadku wydajności Nanoblade. Co więcej, rozmrożonych nanoostrzy nie należy ponownie zamrażać. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

4. Koncentracja nanoostrzy na poduszce z sacharozą

UWAGA: Jako alternatywa dla nocnego wirowania lub ultrawirowania (krok 3.4.3), Nanoostrza mogą być skoncentrowane na poduszce sacharozowej. W ten sposób uzyskuje się czystszą frakcję nanoostrzy, chociaż całkowita odzyskana ilość będzie niższa.

1. Przygotować 10% roztwór sacharozy (od wagowych do objętościowych) w 1x PBS i przefiltrować go przez filtr strzykawkowy 0,2 μm (patrz Tabela Materiałów).
2. Rozpocznij proces koncentracji nanoostrzy na poduszce sacharozy.
   1. Umieścić 9 ml próbki zawierającej VLP (z kroku 3.4.3) w probówce do ultrawirówki (patrz tabela materiałów). Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml i kaniuli powoli ułóż 2,5 ml 10% sacharozy pod próbką, starając się nie mieszać próbki zawierającej VLP z roztworem sacharozy.
   2. Alternatywnie umieść 2,5 ml 10% sacharozy w probówce ultrawirówkowej (patrz Tabela materiałów). Przechylić probówkę i powoli dodać 9 ml próbki zawierającej VLP (z kroku 3.4.3) za pomocą pipetora wolnoobrotowego. Podczas tej operacji stopniowo podnoś rurkę do pozycji pionowej.
3. Odwirować próbki o masie 209,490 × g w ultrawirówce przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
   nuta: Technikę tę można dostosować do wirowania z niską prędkością (4 300 × g) przez noc.
4. Po odwirowaniu ostrożnie usunąć supernatant i umieścić probówkę do góry nogami na bibułce, aby usunąć pozostały płyn. Po upływie 1 minuty dodać 100 μl 1x PBS i umieścić probówkę w temperaturze 4 °C z osłoną parafilmową w uchwycie probówki na stole mieszadlanym na 1 godzinę (patrz Tabela Materiałów) przed ponownym podwieszeniem granulki przez pipetowanie w górę i w dół.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

5. Monitorowanie ładowania Cas9 w Nanoblades za pomocą kropki

1. Przygotować bufor rozcieńczający, dodając 1 objętość buforu do lizy zawierającego niejonowy środek powierzchniowo czynny (patrz tabela materiałów) w 4 objętościach po 1 PBS. Rozcieńczyć 2 μl skoncentrowanych nanoostrzy w 50 μl buforu rozcieńczającego, krótko przemieszać i przenieść 25 μl tej mieszaniny do nowej probówki zawierającej 25 μl buforu rozcieńczającego. Powtórz tę operację, aby uzyskać 4 probówki z rozcieńczeniami Nanoblade (2-krotne kroki rozcieńczania).
2. Dla wzorcowych prób kontrolnych rozcieńczyć 2 μl rekombinowanej nukleazy Cas9 (patrz Tabela materiałów) w 50 μl buforu rozcieńczającego, krótko odwirować i przystąpić do wykonania ośmiu seryjnych rozcieńczeń (2-krotne rozcieńczenie na każdy etap).
3. Ostrożnie narysuj 2,5 μl każdego rozcieńczenia VLP i 2,5 μl każdego wzorca na membranie nitrocelulozowej za pomocą wielokanałowej pipety (większa objętość może spowodować nakładanie się miejsc).
   nuta: Można również zastosować membranę z polifluorku winylu nasączoną metanolem.
4. Gdy cząstki zostaną wchłonięte przez membranę, zablokuj membranę 1x solą fizjologiczną buforowaną Tris zawierającą niejonowy środek powierzchniowo czynny (TBS-T) uzupełniony beztłuszczowym mlekiem w proszku (5% w/v) przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
   nuta: W tym miejscu można wstrzymać protokół, a membranę przechowywać w temperaturze 4 °C w 1x TBS-T.
5. Odrzucić 1x TBST uzupełniony beztłuszczowym mlekiem w proszku i inkubować błonę przez noc w temperaturze 4 °C z przeciwciałem przeciwko peroksydazie chrzanowej Cas9 (rozcieńczenie 1/1000 w 1x TBST, 5% mleka). Umyj membranę 3x za pomocą TBS-T i zwizualizuj sygnał za pomocą ulepszonego zestawu substratów chemiluminescencyjnych.
6. Określ ilościowo intensywność kropek dla rozcieńczeń Nanoblades i rekombinowanego wzorca Cas9 za pomocą zastrzeżonego oprogramowania dostarczonego ze stacją obrazowania żelowego lub imageJ. Zdefiniuj krzywą liniową łączącą intensywność punktu punktowego ze stężeniem Cas9. Korzystając z funkcji otrzymanej krzywej, ekstrapoluj zawartość Cas9 w każdym preparacie.
   nuta: Ilość rekombinowanego białka kontrolnego Cas9 może nasycić odczyt dla najbardziej skoncentrowanych próbek z zestawu do rozcieńczania wzorcowego (ryc. 2). W związku z tym zaleca się, aby przy definiowaniu krzywej liniowej usunąć odczyt z nierozcieńczonych próbek (a czasami odczyt z pierwszych etapów rozcieńczania), jeśli nie mieszczą się one w zakresie liniowym w odniesieniu do znanego stężenia Cas9, które zostało wykryte. Podobnie, ekstrapolując ilość Cas9 w próbkach Nanoblade, należy używać tylko odczytów, które mieszczą się w zakresie liniowym krzywej standardowej.

6. Transdukcja komórek docelowych za pomocą Nanoostrzy (procedura transdukcji w płytce 12-dołkowej)

1. Na 12-dołkowej płytce wysiewaj 100 000-200 000 komórek (pierwotnych lub unieśmiertelnionych komórek przylegających) na dołek w 1 ml odpowiedniej pożywki do hodowli komórkowych. Pozwól komórkom przylegać do powierzchni płytki przed transdukcją.
2. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml dodać 5-20 μl skoncentrowanych nanoostrzy (z kroku 3.5.1 lub 4.4) do 500 μl pożywki do hodowli komórkowych i wymieszać, pipetując w górę i w dół za pomocą pipetora P1000. Usuń pożywkę z komórek i zastąp ją 500 μl tej mieszaniny Nanoblade.
   nuta: Transdukcja musi być zoptymalizowana dla każdego typu komórki. Ważne jest, aby używać jak najmniejszej objętości pożywki (unikając jednocześnie wysuszenia komórek docelowych), aby nanoostrza pozostały wysoce skoncentrowane. Przylegające komórki muszą być transdukowane bezpośrednio po przymocowaniu do płytki (nie należy transdukować w zawiesinie, ponieważ znacznie zmniejszy to wydajność transdukcji). Niektóre komórki tolerują długotrwałą ekspozycję na Nanoostrza (24-48 godzin), podczas gdy inne są bardzo wrażliwe i mogą tworzyć małe syncytia. W takim przypadku nanoostrza należy inkubować z komórkami tylko przez 4-6 godzin przed wymianą pożywki. Spinokulacja może również poprawić transdukcję komórek hodowanych w zawiesinie. Adiuwanty, takie jak polimery kationowe (patrz tabela materiałów), mogą również poprawić wydajność transdukcji w niektórych typach komórek.
3. Po 4-6 godzinach inkubacji komórek w małej objętości pożywki zawierającej nanoostrza, zwiększ objętość pożywki do normalnej ilości (1 ml w przypadku pracy z płytką 12-dołkową) lub zastąp ją świeżą pożywką, jeśli komórki są wrażliwe na VLPs.
   nuta: Pożywkę komórkową zawierającą Nanoblades należy inaktywować 0,5% podchlorynem sodu przez 10 minut przed wyrzuceniem. Używaj rękawic i okularów ochronnych podczas manipulowania podchlorynem sodu. Jeśli nanoostrza wywołują śmierć komórki, dostosuj ilość i całkowity czas ekspozycji, aby zmniejszyć śmiertelność komórek.

Wyniki

Rysunek 1: Morfologia komórek produkcyjnych podczas produkcji Nanoblade.(A) HEK293T komórek przy zbiegu 70-80% 24 godziny po posiewie. (B i C) HEK293T morfologia komórek 24 godziny po transfekcji. (D) HEK293T morfologia komórek 40 godzin po transfekcji. Podziałka = 400 μm.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
13,2 mL, cienkościenne rurki polipropylenowe, 14 x 89 mm - 50 szt.	Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze	331372	Probówki ultrawirówkowe do oczyszczania nanoostrzy
Amersham Protran Premium Western blotting membrany, nitroceluloza	Merck	GE10600004	Membrana nitrocelulozowa do ilościowego oznaczania poziomów Cas9 w oczyszczonych nanoostrzach
BIC-Knebel-CAS9	Addgene powiedział:	119942	Koduje fuzję GAG (F-MLV)-CAS9(sp). Umożliwia wytwarzanie cząstek podobnych do wirusa GAG-CAS9 z komórek produkcyjnych w połączeniu z nadekspresją gRNA i odpowiednimi otoczkami
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Addgene powiedział:	120922	Koduje fuzję GAG-dCAS9-VPR w celu ukierunkowanej aktywacji transkrypcji
ostrze	Addgene powiedział:	134912	Pusty szkielet do klonowania sekwencji sgRNA do zastosowania w systemie Nanoblades
BsmBI-v2	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Przekaźnik R0739S	Enzym restrykcyjny do trawienia wektorów BLADE i SUPERBLADES do klonowania sgRNA
Cas9 (7A9-3A3) Mysi mAb (koniugat HRP) #97982	Technologia sygnalizacji komórkowej	97982S	Przeciwciało anty-Cas9 do oznaczania ilościowego Cas9 metodą dot-blot
Nukleaza Cas9, S. pyogenes	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M0386T	Rekombinowane białko Cas9 do wykorzystania jako odniesienie do bezwzględnej kwantyfikacji ilości Cas9 załadowanego w Nanoblades
Bromek etydyny, roztwór (10 mg/ml w H2O)	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	Do barwienia żeli agarozowych i wizualizacji DNA
Wytrząsarki Fisherbrand Wave Motion	Fisher Naukowy	88-861-028	Stół mieszający do ponownego zawieszenia nanoostrzy po odwirowaniu
Analizator żelu			http://www.gelanalyzer.com; ilościowe określanie intensywności pasma po trawieniu
Producent gąsieków 293T	Takara	632617	Linia komórkowa producenta nanoostrzy
Gibco DMEM, wysoka glukoza, pirogronian	ThermoFisher Naukowy	41966052	Pożywka do hodowli komórkowych dla komórek Gesicle Producer 293T
jetPRIME Zestaw odczynników do transfekcji do DNA i DNA/siRNA	Poliplus	POL114-15	Odczynnik transfekcyjny do produkcji Nanoostrzy w komórkach Gesicle Producer 293T
Millex-AA, 0,80 μm, filtr strzykawkowy	Milipory	SLAA033SS	Filtr strzykawkowy do usuwania zanieczyszczeń komórkowych przed zagęszczeniem nanoostrzy
Millex-GS, 0,22 μm, filtr strzykawkowy	Milipory	SLGS033SS	Filtr strzykawkowy do sterylizacji roztworu poduszki sacharozowej
Millex-HP, 0,45 μm, polieterosulfon, filtr strzykawkowy	Milipory	SLHP033RS	Filtr strzykawkowy do usuwania zanieczyszczeń komórkowych przed zagęszczeniem Nanoostrzy
Zestaw do ekstrakcji żelu DNA Monarch	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	T1020L	Zestaw do ekstrakcji żelu DNA do oczyszczania fragmentu plazmidu pBLADES lub pSUPERBLADES po trawieniu za pomocą BsmBI
NEB Stabilny kompetentny E. coli (wysoka wydajność)	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał C3040I	Kompetentne bakterie do transformacji i amplifikacji plazmidu
Zestaw NucleoBond Xtra Midi do transfekcji plazmidowego DNA	Macherey-Nagel	740410.5	Zestaw Maxipreparation do oczyszczania plazmidowego DNA z hodowanych bakterii
Zestaw do ekstrakcji gDNA nukleospinowego	Macherey-Nagel	740952.5	Ekstrakcja genomowego DNA z transdukowanych komórek
NucleoSpin Plasmid, Mini zestaw do plazmidowego DNA	Macherey-Nagel	740588.5	Minipreparat do oczyszczania plazmidowego DNA z hodowanych bakterii
NucleoSpin Tissue, Mini zestaw do DNA z komórek i tkanek	Macherey-Nagel	740952.5	Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA
Samolot Optima XE-90	Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze	A94471	Ultrawirówka
pBaEVRless	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	Prośby indywidualne należy kierować na adres: els.verhoyen@ens-lyon.fr	Pawian Endogenny retrowirus Rless glikoproteina opisana w Girard-Gagnepain, A. i wsp. Pseudotypowane LV otoczki pawiana przewyższają VSV-G-LV pod względem transferu genów do wcześnie stymulowanych cytokinami i spoczynkowych HSC. Krew 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	Addgene powiedział:	Numer katalogowy: 35614	Enocdes wirus białaczki mysiej knebel i geny pol
pCMV-VSV-G	Addgene powiedział:	8454	Białko otoczki do wytwarzania cząstek retrowirusowych lentiwirusowych i MuLV
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	ThermoFisher Naukowy	14200091	10X PBS do rozcieńczenia w miliporowej wodzie
Odczynnik do transfekcji polibrenu	Millipore Sigma	TR-1003-G	Polimer kationowy, który zwiększa efektywność transdukcji retrowirusowej w określonych komórkach ssaków. Może również umożliwić zależne od wirusa wejście oligodeoksynukleotydu (ODN) w celu naprawy ukierunkowanej na homologię
Sacharoza dla biologii molekularnej, ≥99,5% (GC)	Sigma-Aldrich	S0389-5KG	Sacharoza do przygotowania poduszki do oczyszczania Nanoblade poprzez ultrawirowanie
SUPERBLADE5	Addgene powiedział:	134913	Pusty szkielet do klonowania sekwencji sgRNA do wykorzystania w systemie nanoostrzy (zoptymalizowany pod kątem zwiększenia wydajności edycji genomu przez Chen B i wsp., 2013)
Substrat SuperSignal West Dura o wydłużonym czasie trwania	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy: 34076	Ulepszony substrat HRP do chemiluminescencji (ECL) dla plam Cas9
SW 41 Ti Wirnik wahliwo-kubełkowy	Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze	331362	Rotor do ultrawirowania
SYBR Bezpieczna barwnik żelowa DNA	ThermoFisher Naukowy	S33102	Alternatywa dla bromku etydyny do barwienia żeli agarozowych i wizualizacji DNA
Ligaza DNA T4	Laboratoria biologiczne w Nowej Anglii	Zobacz materiał M0202S	Ligaza DNA do ligacji wektorów BLADE lub SUPERBLADES z dupleksowanymi oligonukleotykami DNA odpowiadającymi zmiennemu regionowi sgRNA
Bufor do lizy zawierający tryton	Preparat Promega	E291A	Bufor do lizy w celu rozbicia nanoostrzy i umożliwienia kwantyfikacji Cas9
ANIMACJA 20	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P9416	Do przygotowania TBST

SZT. powiedział: powiedział: