Mikroiniekcja zarodka komara: technika dostarczania egzogennego DNA do żółtka zarodka Anopheles Gambiae w celu wytworzenia mutacji linii zarodkowej

Streszczenie

Źródło: Carballar-Lejarazú, R. et al, Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (2021).

W tym filmie pokazujemy dostarczanie konstruktu napędu genowego do zarodka komara Anopheles gambiae za pomocą techniki mikroiniekcji zarodka. Procedura ta pozwala na integrację dostarczonego konstruktu DNA, poprzez rekombinację homologiczną, z komórkami linii rozrodczej w celu wytworzenia przekształconej populacji komarów.

Protokół

1. Mikroiniekcja zarodka

1. Za pomocą końcówki do mikroładowarki napełnij igły 2 μl mieszaniny DNA (plazmidowe DNA o stężeniu 300-400 ng/μL. Włóż igłę do uchwytu igły i podłącz rurkę automatycznej pompy ciśnieniowej (rysunek 1).
2. Ważne: Ustaw igłę tak, aby tworzyła kąt 15° z płaszczyzną szkiełka (Rysunek 1).
3. Otworzyć końcówkę igły, ostrożnie dotykając pierwszego jaja komara Anopheles gambiae i wstrzyknąć je, wkładając końcówkę igły ≤ 10 μm w tylny biegun. Udane wstrzyknięcie doprowadzi do niewielkiego ruchu cytoplazmy w komórce jajowej.
4. Użyj elementów sterujących współosiowym stolikiem mikroskopu, aby przejść do następnego jaja i kontynuować wstrzykiwanie.
   1. Aby upewnić się, że końcówka igły pozostaje otwarta i nie jest zatkana, należy nacisnąć przycisk Wstrzyknięcie przed wejściem do innego zarodka i uwidocznić małą kropelkę przy otworze igły.
   2. Jeśli igła zostanie zatkana, naciśnij przycisk Wyczyść, aby wyczyścić igłę i powtórz test wizualizacji kropel. Dostosuj ciśnienie w razie potrzeby, jeśli otwór końcówki igły nieco się powiększy, aby upewnić się, że rozmiar kropli pozostaje mały.
   3. Wstrzyknij ~40-50 jaj za pomocą jednej igły.
      nuta: Upewnij się, że bibuła filtracyjna pozostaje wilgotna przez cały czas. Utrzymać wystarczający nacisk wsteczny na igłę, aby utrzymać ją w czystości. Igłę, której nie można odblokować, należy wymienić na nową. Umieszczanie zarodków, wprowadzanie igły i wstrzykiwanie są łatwiejsze dzięki mikroskopom, które mają współosiowe sterowanie poziomym ruchem stolika (ryc. 2).
5. Po zakończeniu wstrzykiwań spłucz jaja do szklanego pojemnika wyłożonego bibułą filtracyjną i wypełnionego 50 ml dejonizowanego H2O (ryc. 3).
   nuta: Zarodki zaczną się wykluwać 2 dni po wstrzyknięciu i mogą trwać nawet 3-5 dni. Wyklute larwy w pierwszym stadium rozwojowym należy natychmiast przenieść (sprawdzać 2 razy dziennie) do czystego pojemnika z wodą i pokarmem.

Wyniki

Rycina 1: Pozycja igły podczas mikroiniekcji. A) Szerokokątny widok etapu wtrysku. B,C) Ustawić igłę tak, aby wyrównane zarodki tworzyły kąt 15° z igłą do wstrzykiwań. Nie należy podnosić ramienia narzędzia do mikroiniekcji, które trzyma igłę znacznie wyżej niż stolik mikroskopu, aby zapewnić prawidłowe ustawienie pod kątem między igłą a szkiełkiem zawierającym zarodki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10x Bufor do mikroiniekcji	-	-	1 mM bufor NaHPO4, pH 6,8, 50 mM KCl
Blotting membrane (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blotting Membrane)	Bio-Rad		Starannie i prosto pokroić na kawałek o wymiarach 2x1 cm
Woda dejonizowana lub podwójnie destylowana (ddH20)	Mili-Q		W butelce do mycia
Mikroskop preparacyjny	Księga Leica	Leica MZ12	Do wyrównania zarodków
Szklany pojemnik	Pyrex	Nr 3140	Wymiary: 125 x 65
Zjeżdżalnia szklana	Marka Fisher	Nr 12-549-3	Wymiary: 75x26 mm
Mikrowtryskiwacz	Instrument Suttera		Cyfrowy mikrowtryskiwacz XenoWorks
Końcówki do pipet do mikroładowarek	Eppendorf		Mikroładowarka 20 μL epT.I.P.S.
Mikromanipulator	Instrument Suttera		Mikromanipulator XenoWorks
Mikropipeta	Rainin		20 μL
mikroskop	Księga Leica	DM 1000 LED lub M165 FC	Do mikroiniekcji
Siatka nylonowa
Pędzlem	Blick	Nr 05831-7040	Drobna, rozmiar 4/0
szalka Petriego			Tworzywo sztuczne, (60x15 mm, 90x15 mm)