Hydrodynamiczne dostarczanie genów: technika transfekcji in vivo egzogennego DNA w mysich hepatocytach poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej

Streszczenie

Źródło: Hübner, E. K. et al., Konstytutywne i indukowalne systemy do genetycznej modyfikacji hepatocytów myszy in vivo przy użyciu hydrodynamicznego wstrzykiwania żyły ogonowej. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film opisuje technikę genetycznej transfekcji in vivo mysich hepatocytów poprzez hydrodynamiczne wstrzykiwanie żyły ogonowej. Ten system transfekcji generuje długotrwałą ekspresję transgenu w hepatocytach.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.

1. Przygotowanie roztworu do hydrodynamicznej iniekcji żyły ogonowej

UWAGA: Przygotuj konstrukty plazmidu do konstytutywnej i indukowalnej ekspresji genów za pomocą techniki klonowania przy użyciu kompetentnych bakterii.

1. Przygotować sterylny 0,9% roztwór soli fizjologicznej do wstrzykiwań (nie stosować PBS). Użyj objętości odpowiadającej około 10% masy ciała myszy. Przykład: dla myszy o wadze 20 g przygotuj 2 ml roztworu.
2. Przygotuj wektory iniekcyjne, które zostały oczyszczone za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu bez endotoksyn
.
3. Dodaj 10 μg lub 15 μg bezendotoksynowego konstruktu wektorowego śpiącej królewny (użyj 10 μg, z kroku 4 użyj odpowiednio 15 μg) i 1 μg wolnego od endotoksyn pc-HSB5 na ml sterylnego soli fizjologicznej.
4. Przechowywać roztwór do 4 godzin w temperaturze 4 °C. Nie zamrażać.

2. Wykonywanie hydrodynamicznej iniekcji żył ogonowych

1. Do wstrzykiwania żyły ogonowej należy użyć ogranicznika (dostępnego w handlu lub przygotowanego ze stożkowej rurki o pojemności 50 ml z otworami do oddychania i do ogona). Wypełnij dno tuby bibułą.
2. Do wstrzykiwań należy używać myszy w wieku około 8–10 tygodni o wadze 20–25 g.
3. Zważyć myszy przed wstrzyknięciem i przygotować objętość wstrzyknięcia w zależności od masy ciała (odpowiadającej 10% masy ciała). Przygotować sterylną strzykawkę o pojemności 3 ml z igłą 27 G do wstrzykiwań i napełnić wymaganą objętością.
4. Umieść mysz w ograniczniku. Dostosuj ilość bibuły, aby pozostawić tylko minimalną przestrzeń do ruchu, ale wystarczająco dużo miejsca do oddychania.
5. Upewnij się, że mysz regularnie oddycha.
6. Ogrzej ogon za pomocą lampy na podczerwień przez 30-60s. Uważnie obserwuj, czy nie ma oznak przegrzania.
7. Oczyść ogon wacikiem nasączonym alkoholem.
8. Wprowadzić igłę prawie poziomo do jednej z dwóch bocznych żył ogonowych w pobliżu podstawy ogona.
   nuta: W przypadku pomyślnego umieszczenia, niewielka ilość krwi może spłynąć z powrotem do stożka igły. Nie zaleca się aktywnego zasysania, ponieważ każdy dodatkowy ruch igły może spowodować jej przemieszczenie i/lub uszkodzenie żyły.
9. Wstrzyknąć całkowitą objętość do żyły ogonowej w ciągu 8-10 sekund.
10. Natychmiast wyjmij mysz z ogranicznika. Uciskać ranę po wstrzyknięciu przez co najmniej 30 s lub do momentu ustąpienia krwawienia.
11. Umieść mysz w osobnej klatce. Gdy mysz dojdzie do siebie po zabiegu (około 30–60 minut), przenieś mysz z powrotem do pierwotnej klatki. Regularnie sprawdzaj na myszce przez następne 24 godziny < / > nuta: Łagodną sedację myszy obserwuje się rutynowo przez okres do 2 godzin po wstrzyknięciu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
NaCl 0,9%	Braun	3200905	Nośnik do wstrzykiwań dożylnych
Tuba stożkowa Falcon 50ml	Corning Nauki przyrodnicze	352095
Lampa na podczerwień	N/a	N/a	Do ogrzania ogona myszy
Plazmidy do klonowania wektorów transpozonów śpiącej królewny dla HTVI.
pTC (pTC	N/a		Wektor konstytutywnej ekspresji genów
pEN_TTmcs	Addgene powiedział:	#25755	Wektor wejściowy do indukowalnej ekspresji genów
pEN_TTGmiRc2	Addgene powiedział:	#25753	Wektor wejściowy do indukowalnej ekspresji miRshRNA z koekspresją GFP
pEN_TTmiRc2	Addgene powiedział:	Numer katalogowy #25752	Wektor wejściowy dla indukowalnej ekspresji miRshRNA bez koekspresji GFP
pTC ApoE-Tet	Addgene powiedział:	Numer katalogowy #85578	Wektor ekspresyjny do indukowalnej ekspresji genu lub miR-shRNA z promotorem ApoE.HCR.hAAT
pTC-CMV-Tet	Addgene powiedział:	#85577	Wektor ekspresyjny do indukowalnej ekspresji genu lub miR-shRNA z promotorem CMV

) powiedział: powiedział: