Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium: metoda genetycznej transformacji genomu ryżu za pomocą genetycznie modyfikowanych Agrobacterium tumefaciens

Streszczenie

Źródło: Xu, D., et al. Transformacja genetyczna za pośrednictwem Agrobacterium, produkcja transgeniczna i jej zastosowanie do badania rozwoju reprodukcyjnego mężczyzn w ryżu. J. Vis. Exp. (2020).

W tym filmie pokazujemy genetyczną transformację genomu ryżu za pomocą wektora binarnego Agrobacterium tumefaciens. Bakteria ta ułatwia przenoszenie obcego plazmidu DNA za pomocą białek wirulencji Agrobacterium.

Protokół

1. Genetyczna transformacja ryżu i kultura tkanek roślinnych

1. Indukcja i regeneracja kalusa
   nuta: Użyj świeżych młodych kwiatostanów ryżu jako materiału wyjściowego do wywołania kalusa (ryc. 1).
   1. Zbierz młode kwiatostany z pola ryżowego lub szklarni na etapie mejozy, określoną na podstawie długości różyczki 1,6-4,8 mm (ryc. 1A). Upewnij się, że kwiatostany ryżu są pokryte pochwą liściową. Przetrzyj każdy kwiatostan wacikiem nasączonym 70% alkoholem i pozostaw do wyschnięcia przed ścięciem.
   2. Przynieś kwiatostan do czystej, sterylnej ławki. Pokrój go na małe kawałki (im mniejszy, tym lepiej) za pomocą wysterylizowanych nożyczek, a następnie przenieś sadzonki na płytkę Petriego zawierającą pożywkę NBD2 (Rysunek 1B, Tabela 1).
   3. Inkubować płytkę w ciemności w temperaturze 26 °C przez około 10-14 dni w celu wywołania kalusa (ryc. 2A).
      nuta: Nowo utworzony kalus należy wykorzystać do infiltracji Agrobacterium (krok 1.2.7) bezpośrednio lub ponownie przygotować go w świeżej pożywce NBD2, aby uzyskać więcej modzeli. Przenieś kalus do nowego podłoża NBD2 co 8–10 dni.
2. Transformacja i współuprawa
   1. Do transformacji należy użyć bakterii A. tumefaciens zawierających binarny plazmid z konstruktem sgRNA-CAS9. Szczepy A. tumefaciens należy przechowywać w pożywce YEB (Tabela 1) z 50% glicerolem w temperaturze -80 °C do dalszego wykorzystania.
   2. Smugę A. tumefaciens z glicerolu o temperaturze -80 °C do pożywki agarowej YEB zawierającej selektywne antybiotyki (Tabela 1) i wzrost w temperaturze 25–28 °C przez 48–72 godzin, aby umożliwić pojawienie się kolonii.
   3. Zaszczepić pojedynczą kolonię z płytki YEB selektywnymi antybiotykami do 5 ml płynnej pożywki YEB zawierającej te same selektywne antybiotyki (Tabela 1), w stożkowej sterylnej probówce o pojemności 50 ml. Wstrząsać na wytrząsarce orbitalnej o sile 250 x g, w temperaturze 25–28 °C, aż bakterie osiągną OD₆₀₀ 0,5.
   4. Dodać 1 ml zawiesiny bakteryjnej do 100 ml pożywki YEB (Tabela 1) z tymi samymi selektywnymi antybiotykami w kolbie stożkowej o pojemności 250 ml i wstrząsać na wytrząsarce orbitalnej o sile 250 x g, w temperaturze 28 °C przez 4 godziny.
   5. Wirować przy 4 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu zebrania bakterii. Odrzucić supernatant.
   6. Zawiesić osad bakteryjny z pożywką AAM-AS (Tabela 1) i rozcieńczyć zawiesinę do OD₆₀₀ = 0,4.
      nuta: Idealny OD zawiesiny bakteryjnej ma kluczowe znaczenie dla efektywnej transformacji. Pomaga w eliminowaniu nadmiernego wzrostu bakterii na modzeniu.
   7. Zebrać około 150 zdrowych, rosnących, jasnożółtych, kruchych zarodkowych kalisów z kroku 1.1.3 do sterylnej kolby o pojemności 150 ml. Dodać 50-75 ml zawiesiny komórek bakteryjnych z kroku 1.2.6 do sterylnej kolby, a następnie dodać trochę 10-25 ml świeżej pożywki AAM-AS, aby zanurzyć kalusy na 10-20 minut, od czasu do czasu wstrząsając.
   8. Ostrożnie wylać zawiesinę bakteryjną z kolby i osuszyć nadmiar zawiesiny bakteryjnej z modzela za pomocą sterylnej bibuły filtracyjnej #1 lub bibuły. Następnie umieść je na szalce Petriego z pożywką NBD-AS (Tabela 1) pokrytą sterylną bibułą filtracyjną #1. Inkubować w temperaturze 25–28 °C w ciemności przez 3 dni i sprawdzić, czy nie ma przerostu bakterii.
3. Selekcja pod kątem modzela odpornego
   1. Po 3 dniach wspólnej uprawy przenieś kalie na sterylną szalkę Petriego ze sterylną bibułą filtracyjną.
   2. Susz kalię na powietrzu przez 2 godziny na czystej ławce. Upewnij się, że modzel nie przylega do bibuły filtracyjnej.
   3. Przenieść kalusy równomiernie za pomocą sterylnej pęsety na pożywkę pierwszorzędową NBD2 (z 40 mg/l higromycyny i 250 mg/l timentyny) (Tabela 1). Hodowla kalii przez 2 tygodnie w temperaturze 25–28 °C w ciemności.
   4. Po 2 tygodniach przenieść kalie równomiernie na nową płytkę zawierającą świeżą pożywkę selekcyjną NBD2 (z 40 mg/l higromycyny i 250 mg/l timentyną) (Tabela 1). Hodować kalus przez kolejne 2 tygodnie w temperaturze 25–28 °C w ciemności.
4. Różnicowanie kalusa
   1. Przenieść kalus na świeże podłoże MS (z 25 mg/l higromycyny i 150 mg/l timentyny) (Tabela 1). Hodowlę w świetle w temperaturze 25–28 °C przez około 2 tygodnie.
   2. Powtórz krok 1.4.1 jeszcze raz.
   3. Przenieś pąki pędów na nową pożywkę MS (z 10 mg/l higromycyny), aby rozmnożyć więcej pędów.

Tabela 1: Kompozycje mediów do transformacji ryżu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wyniki

Rysunek 1: Materiały wyjściowe do wywoływania modzeli. (A) Młode kwiatostany ryżu na etapie mejozy. (B) Wypreparowane młode kwiatostany rosnące na podłożu NBD2. Pręt = 2 cm w (A).

Rysunek 2: Procedura wytwarzania linii transgenicznych w procesie tran...