1. Elektroporacja dla nadekspresji transgenu receptora Hh: pEGFP-Smo
- Do elektroporacji przy użyciu kuwety o odstępie 2 mm należy przygotować następującą mieszaninę elektroporacji plazmid-ogniwo dla każdej reakcji elektroporacji: 1,2 × 106 mysich pierwotnych komórek ziarnistych móżdżku i 10 μg pEGFP-mSmo (dostosować stężenie wyjściowe DNA do ~2-5 μg/μL w buforze Tris-EDTA lub sterylnym dH2O) w 100 μL Opti-MEM.
nuta: Zmniejsz całkowitą liczbę ogniw, jeśli ogniwa są niewystarczające (chociaż może to zmniejszyć wydajność elektroporacji). Nie należy jednak dostosowywać ilości plazmidu ani całkowitej objętości Opti-MEM użytego na kuwetę. Jeśli całkowita liczba komórek wymaganych w eksperymencie przekracza 1,5 ×10 6 komórek, należy odpowiednio zwiększyć ilość mieszaniny do elektroporacji i przeprowadzić oddzielnie wiele reakcji elektroporacji. Kuweta może być ponownie użyta do 5 razy.
- Przygotować płytkę wysiewającą po elektroporacji, dodając 0,5 ml pożywki hodowlanej do każdego dołka 24-dołkowej płytki hodowlanej zawierającej powlekane szkiełka nakrywkowe i utrzymywać ją w cieple w temperaturze 37 °C w inkubatorzeCO2. W celu przygotowania szkiełek nakrywkowych do przyłączenia do komórek, inkubować szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 mm w autoklawie ze 100 μg/ml poli-D-lizyny (PDL, 1 mg/ml w sterylnym dH2O) przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w tym samym roztworze PDL w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
- Odpipetować wymaganą liczbę komórek do sterylnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować z ciśnieniem 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl Opti-MEM. Powtórz ten krok dwukrotnie z Opti-MEM, aby upewnić się, że w probówce nie ma resztek pożywki hodowlanej.
nuta: Na każdy dołek/szkiełko nakrywkowe na płytce 24-dołkowej należy wykonać elektroporację i wysiać 1,2-1,3 × 106 komórek/studzienkę, aby uzyskać ~70-75% konfluencji komórek w następnym dniu hodowli.
- Ustaw parametry elektroporacji, jak pokazano w Tabeli 1.
- Delikatnie odpipetować reakcję elektroporacji, aby dobrze wymieszać i użyć długiej końcówki P200, aby przenieść dokładną objętość 100 μl mieszaniny do kuwety o szczelinie 2 mm. Unikaj tworzenia się bąbelków.
- Umieść kuwetę w komorze kuwety.
- Naciśnij przycisk Ω elektroporatora (patrz Tabela Materiałów) i zanotuj wartość impedancji, która powinna wynosić ~30-35. Aby upewnić się, że wartość impedancji elektrycznej Ω mieści się w zakresie 30-35, należy przestrzegać dokładnej objętości 100 μl.
- Naciśnij przycisk start, aby zainicjować impuls.
- Zapisz wartości mierzonego prądu i dżuli pokazane na ramce odczytu.
- Wyjmij kuwetę z komory kuwety.
- Natychmiast dodać 100 μl podgrzanej pożywki hodowlanej do kuwety i ponownie zawiesić, delikatnie pipetując w górę i w dół 2-3 razy. Natychmiast przenieść zawiesinę komórek na 24-dołkową płytkę zawierającą powlekane szkiełka nakrywkowe przygotowane zgodnie z krokiem 1.2.
nuta: Aby zminimalizować śmierć komórki, zasiej komórki natychmiast po elektroporacji.
- Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2. Pozostaw komórki w spokoju przez 3 godziny, aby uniknąć oderwania komórek.
- Po 3 godzinach od wysiewu delikatnie odessać i wyrzucić połowę pożywki sklarowanej nad osadem, aby usunąć pływające martwe komórki i zanieczyszczenia, a następnie zastąpić taką samą ilością wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej.
- Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .
.
.
| Ustawienie impulsu poringowego | Ustawienie impulsu transferu |
| Podstawowe punkty GCP myszy | Neurony pierwotne | Podstawowe punkty GCP myszy | Neurony pierwotne |
| napięcie | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| długość | Czas trwania: 1 ms | 0,5 ms | Czas trwania: 50 ms | Czas trwania: 50 ms |
| interwał | Czas trwania: 50 ms | Czas trwania: 50 ms | Czas trwania: 50 ms | Czas trwania: 50 ms |
| Nie. | cyfra arabska | cyfra arabska | 5 | 5 |
| Stawka D | 10% | 10% | 40 proc | 40 proc |
| biegunowość | + | + | ± | ± |
Tabela 1: Parametry elektroporacji pierwotnych GCP myszy i pierwotnych neuronów przy użyciu Super Electroporatora NEPA21 TYPU
