Nukleofekcja form pasożytniczych: metoda transfekcji oparta na elektroporacji polegająca na dostarczaniu plazmidów kodujących białka fluorescencyjne do jądra sporozoitu

Streszczenie

Źródło: Duan, C., et al. Nucleofektion i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka. J. Vis. Exp. (2020)

W tym filmie opisujemy nukleofekcję, procedurę transfekcji opartą na elektroporacji, polegającą na dostarczeniu fluorescencyjnego plazmidowego DNA kodującego białko reporterowe do sporozoitowej formy pasożyta Eimeria kurczaka.

Protokół

1. Nukleofekcja merozoitów lub sporozoitów

1. Przygotowanie przed nukleofekcją pasożytów
   1. Przygotuj około 10-7 merozoitów lub sporozoitów w jednej probówce. W przypadku transfekcji merozoitów przygotuj 3-4 probówki.
   2. Przygotować ilość plazmidowego DNA lub oczyszczonego fragmentu PCR większą lub równą 10 μg.
      nuta: Plazmid użyty w tym badaniu zawiera 2 geny: wzmocnione białko żółtej fluorescencji (EYFP) i syntazę tymidylanu reduktazy dihydrofolianowej pochodzącą z Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS).
   3. Przygotować 25 j. enzymu restrykcyjnego. Jeśli plazmidy są zlinearyzowane, enzym restrykcyjny może poprawić wydajność transfekcji. Jeśli plazmidy są okrągłe, pomiń enzym restrykcyjny.
   4. Przygotować 85 μl buforu nukleofekcyjnego (Tabela 1): zmieszać 20 μl buforu nukleofekcji I i 1 ml buforu nukleofekcji II i użyć części roztworu. Objętość całkowitego buforu wynosi 100 μl.
2. Jądrofelekcja
   1. Odwirować zawiesinę sporozoitu lub merozoitu o stężeniu 600 x g przez 10 min. Następnie odrzucić supernatant.
   2. W następującej kolejności dodaj 85 μl buforu do transfekcji jądrowej, 10 μg plazmidu (fragment PCR) i 25 U enzymu restrykcyjnego (zwykle 5 μl) do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej sporozoity lub merozoity.
   3. Przenieść zawiesinę do kubka do transfekcji jądrowej. Umieść kubek w rowku do przenoszenia jądra.
   4. Włącz urządzenie nukleofekcyjne za pomocą przycisku zasilania i wybierz procedurę transfekcji U-033. Jeśli urządzenie nukleofekcyjne uruchamia się w trybie swobodnego wyboru programu, wyjdź z tego trybu, naciskając przycisk X.
   5. Po zakończeniu programu naciśnij przycisk X urządzenia nukleofekcyjnego, a na ekranie powinien pojawić się OK, wskazując, że nukleofekcja się powiodła.
   6. Dodaj 0,5-1 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco do kubka na nukleofekcję, aby zatrzymać reakcję i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 1,5 ml po delikatnym wymieszaniu.

bufor	kompozycja
Bufor nukleofekcyjny I	ATP-disód 2g, MgCl2-6H 2O 1,2g, 10 ml wody
Bufor nukleofekcyjny II	KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glukoza 0,2 g, 500 ml wody
*woda: woda destylowana

Tabela 1: Skład.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM (DMEM)	MACGENE	CM15019
Urządzenie do nukleofekcji	LONZA/amaxa	90900012 (Nucleofector II)
glukoza	Sigma	Nr V900116
ATP-disod	Sigma	Nr kat. A26209
Celuloza DE-52	Solarbio (Słoneczna Biologia	Zobacz materiał C8350
KH2PO4	Sigma	Nr V900041
Wirówka wolnoobrotowa	PEKIŃSKA WIRÓWKA BEILI CENTRIFUGE CO., LTD.	Zobacz materiał DT5-2
MgCl2	Sigma	449164
NaHCO3	Sigma	144-55-8
Pbs	Solarbio (Słoneczna Biologia	Zobacz materiał P1010
Wirówka do mikrowirówek Sorvall Legend Micro 17	ThermoFisher Naukowy	75002430
trypsyna	Solarbio (Słoneczna Biologia	Zobacz materiał T8150
Percoll (gradientowy roztwór podstawowy DG)	GE Opieka zdrowotna	17-0891-09