$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Usuń komórki wzgórka z zapłodnionych jaj.
- Pod mikroskopem stereoskopowym użyj 2 strzykawek insulinowych: pierwszej do przytrzymania jajowodu, a drugiej do rozerwania bańki i rozproszenia zapłodnionych jaj w roztworze roboczym hialuronidazy.
- Weź przygotowaną szklaną pipetę do zbierania jaj i podłącz ją do rurki i filtra 0,22 μm zamontowanego na ustniku, aby zassać wszystkie jaja. Zbierz wszystkie jajka i umyj je kolejno przechodząc do 6 różnych kropli po 100 μl pożywki M2.
- Umyte zapłodnione jaja umieścić w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 w pożywce M16.
2. Produkcja pipet iniekcyjnych
- Użyj cienkościennej szklanej rurki kapilarnej (o długości 10-15 cm) o średnicy zewnętrznej 1 mm i zaciśnij tę kapilę w poziomym ściągaczu do mikropipet.
nuta: W większości poziomych ściągaczy do pipet można regulować 3 parametry: moc cieplną, siłę ciągnięcia i opóźnienie czasowe między nagrzewaniem a wyciąganiem. Dostosuj te parametry, aby uzyskać pipety do wstrzykiwania podobne do przedstawionej na rysunku 1A. W przypadku użytkowników, którzy rutynowo wykonują mikroiniekcję DNA, należy skorzystać ze standardowych ustawień i dostosować opóźnienie między podgrzewaniem a ciągnięciem, aby zmienić globalny kształt końcówki pipety.
3. Produkcja pipet do trzymania
- Użyj pipety do wstrzykiwań, aby przygotować pipetę podtrzymującą.
- Podłącz pipetę iniekcyjną do mikrokuźni. Przeciąć pipetę za pomocą mikrokuźni, aby uzyskać ostrą, symetryczną końcówkę o średnicy od 80 do 100 μm. Następnie wypoleruj końcówkę na gorąco na mikrokuźni, aby uzyskać symetryczny okrągły kształt bez ostrych żywopłotów.
4. Przygotowanie pipety iniekcyjnej zawierającej wektor lentiwirusowy
- Odwirować zawiesinę wektora lentiwirusowego o sile 160 x g przez 2 minuty w celu osadzenia szczątków często obecnych w zamrożonych zapasach lentiwirusa.
- Odzyskać supernatant i przenieść go do nowej probówki o pojemności 0,5 ml w komorze bezpieczeństwa klasy II.
- Przenieść 1 μl supernatantu do pipety iniekcyjnej przygotowanej zgodnie z opisem w kroku 5 za pomocą mikroładowarki.
- Ustawić pipetę iniekcyjną na uchwycie narzędzia prawego mikromanipulatora. Podłączyć pipetę podtrzymującą do lewego mikromanipulatora.
nuta: Miano transdukcji wektora lentiwirusowego będzie bezpośrednio skorelowane ze skutecznością produkcji założyciela. Aby uzyskać wysoką skuteczność (>70%), należy stosować wektory wirusowe o mianowaniu w zakresie 100 ng białka kapsydu p24/μl. Gdy miano jest wyrażone w jednostkach transdukcji (TU), miano powinno być wyższe niż10,9 TU/ml. Stada wektorów lentiwirusowych muszą być wytwarzane przez przejściową transfekcję komórek 293T z plazmidem enkapsydacyjnym p8.91, pHCMV-G, kodującym glikoproteinę G wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV), jak opisano w metodach uzupełniających.
5. Mikroiniekcja
- Dozować 8 μl podłoża M2 na środek szkiełka wgłębnego i zalać lekkim olejem parafinowym (badany na zarodkach), aby uniknąć parowania.
- Umieść 20 jaj w kropli tak jak najmniej rozproszonej.
ostrożność: Nie rób bąbelków podczas deponowania zarodków.
- Upewnij się, że końcówka pipety iniekcyjnej jest otwarta. W przeciwnym razie postukaj w pipetę iniekcyjną pipetą przytrzymującą.
- Ustawić mikrowtryskiwacz na czas wstrzykiwania 20 s.
nuta: Lepkość zawiesiny wirusa pozwala na wyraźną wizualizację dyspersji wektora wirusowego w przestrzeni perywitelinowej. Ciśnienie iniekcji powinno być dostosowane tak, aby wypełniło całą przestrzeń w ciągu 20 s od wstrzyknięcia, co odpowiada objętości od 10 do 100 pl. Ciśnienie wtrysku nie powinno przekraczać 600 hPa.
- Odessać jedną zapłodnioną komórkę jajową, która zawiera 2 przedjądrza i 2 ciała polarne, za pomocą pipety trzymającej pod mikroskopem stereoskopowym.
- Wstrzyknąć komórkę jajową za pomocą mikrowstrzykiwacza w przestrzeń okołokomórkową.
ostrożność: Nie dotykać błony komórkowej pipetą do wstrzykiwań.
- Wstrzyknąć wszystkie zapłodnione jaja dostępne w partiach po 20 jaj i natychmiast umieścić wstrzyknięte jaja we wstępnie podgrzanym podłożu M16 w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2,
nuta: Inkubować wstrzyknięte jaja przez co najmniej 30 minut po wstrzyknięciu przed transferem zarodków.
