Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych: technika przenikania zapłodnionych jaj myszy w celu ułatwienia dostarczania genów lentiwirusowych

Streszczenie

Źródło: Martin, N. P., et al. Laserowo wspomagane dostarczanie genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy. J. Vis. Exp. (2018).

W tym filmie demonstrujemy wspomagane laserem przenikanie warstwy ochronnej osłonki przejrzystej do zapłodnionych jaj myszy w celu ułatwienia dostarczania genów lentiwirusowych. Lentiwirus umożliwia generowanie zwierząt transgenicznych, których gen jest stabilnie zintegrowany z ich genomem.

Protokół

1. Perforacja jaj zapłodnionych myszami za pomocą lasera XYClone

1. Ustaw i skalibruj laser XYClone zgodnie z zaleceniami producenta. Inne lasery, zwykle używane do zapłodnienia in vitro, mogą być zastąpione laserem XYClone do perforacji zapłodnionych jaj.
   1. Podłącz przewód skrzynki kontrolera lasera do aparatu laserowego w mikroskopie.
   2. Podłącz skrzynkę kontrolera lasera do komputera, na którym działa oprogramowanie lasera, przez port USB. 3.1.3. Podłącz kontroler lasera i włącz go.
   3. Patrząc przez okular, należy przebić próbkę testową (np. oznaczenia suchościeralne na szkiełku podstawowym).
   4. Użyj małego śrubokręta (dołączonego do zestawu laserowego), aby wyregulować pozycję X i Y lasera tak, aby pasowała do światła LED widocznego przez okular mikroskopu i skalibruj laser.
2. Umieść płytkę KSOM zawierającą zapłodnione myszami jaja na stoliku mikroskopowym. Nie należy trzymać płytki poza inkubatorem dłużej niż 15 minut.
3. Spójrz przez okular mikroskopu i upewnij się, że osłonka przejrzysta zarodka jest ostra, a światło lasera LED jest widoczne.
4. Przesuń stolik mikroskopu, aby wycelować w strefę za pomocą światła/lasera LED.
5. Za pomocą oprogramowania komputerowego ustaw laser XYClone na 250 μs.
6. Dostosuj rozmiar światła LED do żądanych wymiarów (ustawienie 5 w tym eksperymencie).
7. Trzykrotnie przedziurawij strefę każdego zapłodnionego jaja za pomocą lasera. Zona może być przekłuta lub przerzedzona. Korzystając z powyższych ustawień, laser wytworzy otwór o średnicy 10 μm (rysunek 1).
   nuta: Celowanie blisko ciała biegunowego utrzymuje laser z dala od komórki embrionalnej.
8. Pozwól zapłodnionym jajom zregenerować się przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli tkankowych przed przejściem do następnego etapu.

2. Transdukcja jaj zapłodnionych przez myszy po perforacji lasera XYClone

1. Odmierzyć pipetą 2 μl stężonego lentiwirusa (miano większe niż 1e8 j./ml) do kropli KSOM o objętości 50 μl. Nie pipetować w górę i w dół. Zapłodnione jaja łatwo przyczepiają się do końcówki pipety. Z naszego doświadczenia wynika, że jednostki transdukcyjne 1e5-5e5 lentiwirusa w objętości mniejszej niż 3 μl są optymalne do dostarczania genów.
2. Pozwól, aby zapłodnione jaja rozwinęły się w blastocystę przez 4 dni w inkubatorze. Nie ma potrzeby wymiany nośnika.

3. Niechirurgiczny transfer transdukowanych embrionów myszy do myszy pseudociężarnych

1. Użyj myszy w ciąży rzekomej, 3,5 dnia po kryciu.
2. Użyj urządzenia do niechirurgicznego transferu zarodków (NSET), aby wszczepić zarodki myszy myszom w ciąży rzekomej.
   1. Za pomocą mikroskopu chirurgicznego lub preparacyjnego włóż wziernik dopochwowy, aby uwidocznić szyjkę macicy.
   2. Wprowadzić urządzenie do niechirurgicznego transferu zarodków (NSET) około 5 mm do szyjki macicy i zdeponować zarodki w objętości około 2 μl.
      nuta: Do każdego transferu używane jest sterylne urządzenie NSET, które po zabiegu jest wyrzucane. Wszystkie odczynniki używane do manipulowania zarodkami muszą być sterylne.
3. Przenieś 10-15 zdrowych blastocyst w objętości 2 μl KSOM do każdej myszy w ciąży rzekomej.
4. Kontynuuj monitorowanie i pomiar przyrostu masy ciała u myszy w ciąży rzekomej w kolejnych dniach, aby ustalić, czy NSET był skuteczny.
5. Odzyskaj młode, pozwalając ciężarnym myszom urodzić naturalnie lub wykonując cesarskie cięcie 17 dni po transferze zarodków. Cesarskie cięcie jest często konieczne, jeśli obecnych jest bardzo mało zarodków i rosną one zbyt duże, aby można je było urodzić naturalnie.
6. Zbierz tkankę od młodych do genotypowania, aby określić szybkość transgenezy.

Wyniki

Rysunek 1: Laserowe leczenie jaj zapłodnionych myszami. Przykłady perforacji strefy w celu wytworzenia i przerzedzenia strefy.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Plazmid CD510B-1	Nauki biologiczne systemowe	CD510B-1	służy do pakowania lentiwirusa wykazującego ekspresję EF1a-copGFP
Dimetylopolisiloksan	Sigma	Czujnik DMPS5X	hodowla zarodków
Laser XYClone	Hamiltona Thorne'a Nauki biologiczne		perforacja jaj zapłodnionych myszami
Niechirurgiczne urządzenie do transferu zarodków (NSET)	ParaTechy	Numer katalogowy: 60010	NSET zarodków
KSOM średni	Milipory	MR-020P-5F	hodowla zarodków
Skład KSOM:			mg/100 ml
Zawartość NaCl			Okręg wyborczy 555
Kcl			18,5
KH2PO4			Godzina 4,75
MgSO4 7H2O			Godzina 4,95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
glukoza			3.6
Na-pirogronian			2.2
Kwas DL-mlekowy, sól sodowa			0,174 ml
10 mM EDTA			100μL
Streptomycyny			5
penicylina			6,3
0,5% czerwieni fenolowej			0,1 ml
L-glutamina			Rozdział 14,6
Aminokwasy egzogenne MEM			1 ml
MEM Nieistotne AA			0,5 ml
Bsa			100

TGL pkt. powiedział: powiedział: szt. szt.