Transfer genów za pośrednictwem biolistyki: technika dostarczania interesującego genu do komórek docelowych za pomocą biolistycznego pistoletu genowego

Streszczenie

Źródło: Taylor, T., et al. Biolistyczna transformacja genu oznaczonego fluorescencyjnie w oportunistyczny patogen grzybowy Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (2015).

W tym filmie demonstrujemy protokół dostarczania genów za pośrednictwem pistoletu genowego w hodowanych komórkach. Metoda ta zapewnia prostą metodę stabilnej transformacji genetycznej przy użyciu minimalnej ilości DNA.

Protokół

1. Przygotowanie DNA

1. Przygotuj pomarańczowe krążki biolistyczne makronośnika, zanurzając je w 100% etanolu za pomocą kleszczy. Umieść krążki na dużej szalce Petriego zawierającej suszyt do wyschnięcia (upewnij się, że suszarka nie dotyka krążków).
2. Po wyschnięciu wciśnij krążki makronośne w srebrne uchwyty krążków (uprzednio przetarte 100% etanolem).
3. Złote kulki mikronośne Vortex zawieszone w 100% etanolu i podwielokrotności 12 μl do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml, po jednej probówce na transformację.
4. Do każdej probówki dodać kolejno: 2 μg DNA (najlepiej 2 μl z 1 μg/μl DNA), 10 μl 2,5 M CaCl₂ i 2 μl 1 M zasady wolnej od spermidyny.
5. Ustal kontrolę negatywną, jak w kroku 1.4, ale bez DNA.
6. Wirować każdą probówkę i inkubować w temperaturze otoczenia przez 5 minut. Od czasu do czasu delikatnie przesuwaj każdą probówkę, aby ponownie zawiesić osadzone kulki podczas tej inkubacji.
7. Obracaj probówki o gramaturze 225 x g przez 30 sekund, aby ogrywać złote kulki pokryte DNA. Ostrożnie usunąć supernatant (przez pipetowanie lub aspirację) i wyrzucić.
8. Całkowicie zawiesić kulki w 600 μl 100% etanolu, powoli pipetując w górę iw dół.
9. Wiruj probówki o masie 225 x g przez 30 sekund, aby granulować kulki bez pakowania. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant.
10. Ponownie zawiesić złote kulki pokryte DNA w 8 μl 100% etanolu, powoli pipetując w górę iw dół.
11. Odpipetować złote kulki pokryte DNA na środek krążka biolistycznego o średnicy 1 cm i pozostawić do wyschnięcia.
    nuta: Wysuszony złoty okrąg widoczny w środku dysku biolistycznego wskazuje, że obecne jest wystarczające stężenie złotych koralików.
    nuta: Dyski makronośnikowe załadowane złotymi kulkami pokrytymi DNA są teraz gotowe do użycia z pistoletem genowym.

2. Obsługa pistoletu genowego

1. Włącz pompę próżniową.
2. Włącz gazowy hel, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aż do osiągnięcia ciśnienia około 2,200 psi na manometrze.
3. Włącz pistolet genowy, przestawiając czerwony przełącznik po lewej stronie.
4. Upewnij się, że natężenie przepływu próżni i odpowietrznika jest wyregulowane tak, aby próżnia osiągnęła 28 cali Hg w ciągu 15 sekund.
5. Upewnij się, że odległość między płytką bezpieczeństwa a makronośnikiem wynosi około 3/8 cala.
6. Wyczyść całą komorę, przecierając ją etanolem.
7. Zanurz płytki bezpieczeństwa w 100% etanolu. Pozostawić do wyschnięcia na sterylnej powierzchni (np. na szalce Petriego).
8. Użyj klucza dynamometrycznego, aby poluzować uchwyt płytki bezpieczeństwa. Włóż czystą płytkę bezpieczeństwa do uchwytu. Przykręć uchwyt płytki bezpieczeństwa z powrotem na miejsce i dokręć kluczem dynamometrycznym, obracając go raz w prawo.
   nuta: Płytki bezpieczeństwa będą wymieniane po każdym strzale strzału.
9. Zanurz sita siatkowe w 100% etanolu. Pozostawić do wyschnięcia na sterylnej powierzchni (np. na szalce Petriego).
10. Po wyschnięciu umieść umytą siatkową siatkę na białej plastikowej płycie montażowej. Umieść uchwyt dysku makronośnika stroną DNA do dołu w komorze dysku. Przykręć srebrną nasadkę i umieść płytę montażową w najwyższym gnieździe.
    nuta: Sito siatkowe będzie wymieniane po każdym ujęciu.
11. Umieścić płytkę agarową YPD zawierającą 1 M sorbitol na dolnej płytce.
12. Zamknij drzwi komory i zablokuj na miejscu.
13. Naciśnij i przytrzymaj środkowy czerwony przełącznik w górę, aby włączyć podciśnienie i pozwól, aby próżnia osiągnęła 28 cali Hg. Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu podciśnienia przesuń ten przełącznik do dolnej pozycji. Gdy będziesz gotowy, przytrzymaj czerwony przełącznik po prawej stronie, aby wystrzelić. Gdy płytka bezpieczeństwa wyskoczy, natychmiast zwolnij przycisk ognia i przesuń środkowy czerwony przełącznik do środkowego położenia, aby odpowietrzyć komorę do 0 psi.
14. Oczyść resztki płytki pęknięcia i wyłącz pistolet genowy. Następnie wyłącz gazowy hel, obracając pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a na koniec wyłącz pompę próżniową.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Złote koraliki 0,6 μm	Bio-Rad	165-2262	http://www.bio-rad.com
Baza bez spermadyn	Sigma- Aldrich	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
Płytki bezpieczeństwa 1350 psi	Bio-Rad	Numer katalogowy: 165-2330	http://www.bio-rad.com
Ekrany zatrzymywania	Bio-Rad	165-2336	http://www.bio-rad.com
Dyski makronośników	Bio-Rad	165-2335	http://www.bio-rad.com
System PDS-1000/He	Bio-Rad	165-2257	http://www.bio-rad.com
Wirówka Microfuge 18	Beckman Coulter	F241.5P	www.beckmancoulter.com

powiedział: