$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Powłoka naczynia z poliornityny/laminy (Po/L)
UWAGA: Objętości są dostosowane do pokrycia płytki 24-dołkowej.
- W razie potrzeby umieść w studzience sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm.
- Pokryj studzienki 500 μl 10 μg/ml roztworu poli-L-ornityny rozpuszczonego w wodzie.
- Pozwól studzienkom osiąść w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
- Usuń roztwór poli-L-ornityny i susz na powietrzu przez 30 minut.
- Studzienki pokryć na noc w temperaturze 37 °C 500 μl lamininy o stężeniu 3 μg/ml w wodorowęglanie L-15,
nuta: Studzienki można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez 7 dni. W przypadku długich inkubacji dodanie sterylnego PBS między studzienkami może pomóc w uniknięciu parowania pożywki.
2. Kultura neuronów ruchowych
- Rozcieńczyć MN do odpowiedniej gęstości, zwykle od 5 000 do 10 000 komórek w 500 μl pożywki hodowlanej na basenie na płytce 24-dołkowej.
nuta: Gęstość wysiewu wynosi około 30 000 i 1 500 komórek odpowiednio dla płytek 6- i 96-dołkowych.
- Usuń roztwór lamininy za pomocą P1000.
- Natychmiast przenieść MN rozcieńczone w pożywce hodowlanej na płytki powlekające, aby uniknąć wysuszenia.
- Inkubować kulturę przez 2 dni w temperaturze 37 °C.
3. Magnetofekcja neuronów ruchowych
UWAGA: W poniższych krokach, użyte ilości są przeznaczone do transfekcji jednego dołka z płytki 24-dołkowej. Zapoznaj się z protokołem producenta, aby uzyskać inny format.
- W celu przygotowania DNA należy ponownie zawiesić 1 μg DNA w 50 μl pożywki do hodowli neuronów i wirować przez 5 sekund. W tym przypadku stosuje się plazmidy o wielkości 9 kb z promotorem CAGGS (pCAGEN) kontrolującym cDNA neurofilamentu.
- W celu przygotowania rurki perełkowej należy ponownie zawiesić 1,5 μl kulek w 50 μl pożywki do hodowli neuronów.
- Dodać 50 μl roztworu kulek do 50 μl roztworu DNA i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej (całkowita objętość = 100 μl).
- Podczas tej inkubacji należy pobrać 100 μl pożywki hodowlanej z dołka, który będzie transfekowany.
UWAGA: Umieść płytkę magnetyczną w inkubatorze, aby ogrzać ją do 37 °C.
- Przenieść 100 μl mieszaniny DNA/kulek do studzienki i inkubować płytkę przez 20–30 minut na płytce magnetycznej w temperaturze 37 °C.